УДК 634.74 Прочие ягодные культуры
Цель исследования – усовершенствование технологии клонального микроразмножения княженики для массового получения посадочного материала. Исследования проводили в 2022–2023 гг. в лаборатории биотехнологии растений Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН). В опыте были использованы гибридные сорта Rubus arcticus L.: Beata, Sofia, Anna и Astra. Изучено влияние различных регуляторов роста и их концентраций на регенерацию эксплантов R. arcticus L. При культивировании на питательных средах с различными концентрациями 6-бензиламинопурином (6-БАП) не было установлено существенного различия по числу микропобегов у сортов княженики. На питательной среде с добавлением 1,0 мг/л 6-БАП экспланты княженики образовывали максимальное число микропобегов (2,93 шт.). Отмечено значительное влияние типа цитокинина и их сочетаний на коэффициент размножения, высоту и число микропобегов княженики. Культивирование на питательной среде с добавлением 1,0 мг/л тидиазурона и 6-БАП способствовала образованию наибольшего числа микропобегов ((4,33 ± 0,88) шт.) и максимальному коэффициенту размножения (14,33 ± 0,84) у княженики in vitro. Установлено значительное влияние генотипа и регуляторов роста на укореняемость микропобегов R. arcticus. Наименьшим процентом укоренившихся микропобегов характеризовался сорт Beata (61,5 %), средними значениями – Anna (65 %) и Astra (72 %), максимальным – Sofia (77 %). Питательная среда с добавлением 0,5 мг/л ИУК способствовала активному укоренению микропобегов княженики (82 %).
Rubus arcticus, клональное микроразмножение, цитокинины, ауксины, коэффициент размножения, укореняемость
Введение. На сегодняшний день возрастает интерес к малораспространеным культурам с высоким содержанием биологически активных веществ и уникальными вкусовыми качествами. Одной из таких культур является княженика (Rubus arcticus L.).
R. arcticus представляет собой невысокое, до 30 см, многолетнее растение с тонким ползучим корневищем, образующим выводковые почки. Княженика цветет в июне-июле розовыми цветками. Плоды, темно-пурпурные, похожие на малину, созревают в июле-сентябре. Ареал княженики простирается в субарктическом поясе Евразии и Северной Америки [1].
Отличительной особенностью R. arcticus является вкус и аромат плодов, который обусловлен комбинацией из более 60 различных ароматических соединений [2]. Содержащиеся в листьях флавоноиды и сапонины, а в плодах производные фурана, фенолы и антоцианы, и другие биологически активные вещества оказывают противовоспалительное и радиопротектерное действие [3]. Таким образом, растение R. Arcticus является ценным сырьем не только для изготовления продуктов питания и виноделия, но и для фармацевтического производства.
Княженику можно использовать и как декоративную культуру. В естественных условиях произрастания встречаются экземпляры с махровыми светло-лиловыми цветками, которые можно использовать как цветовой акцент в альпийских горках и рокариях. Растение подходит для моновидовых композиций [4].
Несмотря на большое число хозяйственно ценных качеств, промышленные насаждения R. arctica немногочисленны и расположены, преимущественно, в странах Северной Европы. Возможно, это связано с низкой урожайностью и прихотливостью растения вначале введения в культуру. Mespi и Mesma были первыми культиварами, полученными в Финляндии на основе R. arctica. Последующее скрещивание R. arctica с R. arcticus subsp. stellatus (Sm.) B. Boivin позволило создать сорта с большим размером плодов, но все еще уступающих по урожайности другим представителям рода Rubus. Селекция R. arctica ведется и в России. Так, Д.Н. Зонтиковым и другими предложена методика получения гаплоидных растений R. arcticus для последующего создания гибридных линий [5, 6].
Традиционные способы вегетативного размножения княженики не способны удовлетворить повышающийся спрос на посадочный материал. Кроме этого, плантациям R. arcticus свойственно быстро истощаться: через 3–4 года урожайность культуры резко снижается, а осушение ее естественных мест обитания и вытаптывание лесных угодий способствуют постепенному исчезновению княженики из дикой природы [7].
Таким образом, разработка протоколов клонального размножения in vitro княженики, позволяющих получать в относительно короткое время большое количество генетически однородного, оздоровленного посадочного материала становится важной для промышленного производства [8].
Некоторые особенности культивирования R. arcticus in vitro были изучены зарубежными и отечественными учеными. В исследованиях Harri I. Kokko и др. успешно размножали R. Arcticus и R. saxatilis на питательной среде с добавлением 6-бензиламинопурина в концентрации 1,5 мг/л [9]. Этапы собственно клонального микроразмножения и укоренения описаны в работах С.С. Макарова и Д.Н. Зонтикова [10, 11]. Однако данные по оптимальным регуляторам роста для культивирования R. arcticus in vitro не однозначны, что делает актуальным дальнейшее совершенствование протокола клонального микроразмножения княженики.
Цель исследования – усовершенствование технологии клонального микроразмножения княженики для массового получения посадочного материала.
Объекты и методы. Исследования проводили в 2023–2024 гг. в лаборатории биотехнологии растений ГБС РАН. В качестве объектов исследования использованы сорта, относящиеся к гибридам R. Arcticus × R. arcticus subsp. stellatus: Beata, Sofia, Anna и Astra.
На этапе собственно микроразмножения применяли минеральную основу питательной среды Murashige and Skoog (MS).
В первом опыте проводили сравнение различных концентраций 6-БАП: 0,3; 0,5; 1,0 мг/л и безгормональной питательной среды в качестве контрольного варианта.
Во втором опыте оценивали действие различных цитокининов (6-БАП, тидиазурон (ТДЗ), метатополин (мТ)) и их сочетаний в концентрации 1,0 мг/л на морфогенез сортов княженики in vitro. Через 45 дней учитывали высоту микропобегов, число микропобегов и коэффициент размножения. Коэффициент размножения рассчитывали, как произведение среднего числа эксплантов, полученных с одного микропобега, и числа микропобегов, образованных у одного экпланта.
На этапе укоренения микропобеги княженики высаживали на питательную среду 1/2 MS с добавлением 20 г/л сахарозы. В исследовании анализировали влияние ИУК и ИМК в концентрациях 0,3 мг/л и 0,5 мг/л на укореняемость микропобегов.
Экспланты культивировали при температуре (23 ± 2) °С, фотопериоде 16/8 и освещенности 2000 лк. Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ SPSS Statistics 23. Для сравнения средних величин и установления статистически значимые различий применяли множественный ранговый критерий Дункана. Варианты опыта, отмеченные одинаковыми буквами, не имеют статистических различий при p < 0,05.
Результаты и обсуждение. Рост и развитие тканей растения на этапе собственно микроразмножения зависит от выбора оптимальных регуляторов роста и их концентрации [12]. При культивировании in vitro наиболее часто используют 6-БАП. В ходе изучении влияния концентраций 6-БАП на биометрические показатели эксплантов княженики, статистически значимые различия выявлены только по числу микропобегов (рис. 1).
Рис. 1. Влияние концентраций 6-БАП на число микропобегов княженики в культуре in vitro
(различными буквами обозначены варианты, имеющие значимые различия по критерию Дункана при p < 0,05)
В ходе дисперсионного анализа установлено существенное различие по числу микропобегов между контрольным вариантом опыта и вариантами с добавлением 6-БАП в различных концентрациях в состав питательной среды. Однако, экспланты, культивируемые на питательных средах с различной концентрацией 6-БАП, статистически не различались по данному показателю. Использование 6-БАП стимулировало образование адвентивных микропобегов при любой концентрации, максимальное число микропобегов получено на питательной среде с добавлением 1,0 мг/л 6-БАП и составило 2,93 шт. При культивировании на питательной среде без добавления 6-БАП экспланты княженики образовывали минимальное число микропобегов – 1,45 шт. Это согласуется с работами других ученых. Для некоторых представителей рода Rubus оптимальной является концентрация в питательной среде 6-БАП в пределах от 0,5 до 1,5 мг/л [13]. Для дальнейшего изучения влияния источников цитокинина на размножение княженики in vitro выбрана концентрация 1,0 мг/л.
Некоторые исследователи отмечали положительный эффект при совместном использовании в питательной среде на этапе микроразмножения двух источников цитокинина [14]. В ходе опыта установлены существенные различия по высоте, числу микропобегов и коэффициенту размножения княженики, при использовании различных цитокининов и их сочетаний (табл.).
Влияние различных цитокининов и их сочетаний
на биометрические показатели эксплантов княженики
|
Источник цитокинина* |
Высота микропобегов, мм |
Число микропобегов, шт. |
Коэффициент размножения |
|
6-БАП |
19,44±0,83а |
2,56±0,73e |
11,11±2,91g |
|
ТДЗ |
14,16±1,07с |
2,70±0,38e |
12,63±1,63fg |
|
мТ |
18,06±0,97ab |
2,12±0,34e |
10,29±0,69g |
|
6-БАП+мТ |
18,05±0,73ab |
2,00±0,28e |
10,80±1,14g |
|
6-БАП+ТДЗ |
13,33±1,67c |
4,33±0,88d |
14,33±0,84f |
|
мТ+ТДЗ |
15,85±0,90bc |
3,11±0,45de |
12,33±1,64fg |
*Концентрация каждого регулятора роста в варианте – 1,0 мг/л. Различными буквами обозначены варианты, имеющие значимые различия по критерию Дункана при p < 0,05.
Однофакторный дисперсионный анализ показал существенные различия по биометрическим показателям эксплантов княженики при использовании различных источников цитокинина в составе питательной среды. При культивировании на питательной среде, содержащей 1,0 мг/л 6-БАП совместно с 1,0 мг/л ТДЗ, выявлено наибольшее число микропобегов (4,33 ± 0,88 шт.) и максимальный коэффициент размножения (14,33 ± 0,84). Стоит отметить снижение высоты микропобегов при культивировании на питательных средах с добавлением ТДЗ, высота микрокропобегов варьировала в пределах от 13,33 до 14,6 мм. Схожие результаты были получены Н.В. Соловых при культивировании малины душистой: ТДЗ способствовал снижению высоты микропобегов [15]. Применение мТ при клональном микроразмножении княженики оказался малоэффективен, но может быть применен совместно с другими цитокининами, так как способствовал увеличению высоты микропобегов.
Этап укоренения важен для последующего культивирования регенерантов в условиях ex vitro. Двухфакторный дисперсионный анализ показал достоверное влияние генотипа и источника ауксина на укореняемость микропобегов различных сортов княженики. Сорта княженики различались по способности к корнеобразованию (рис. 2).
Наибольшим процентом укоренившихся микропобегов характеризовался сорт Sofia (77 %), минимальным – сорта Beata и Anna (62 и 65 % соответственно). Сорт Astra занимал промежуточное значение – 72 %.
В нашем исследовании укореняемость микропобегов княженики зависела от применяемого ауксина и его концентрации (рис. 3).
Рис. 2. Влияние генотипа на укореняемость микропобегов княженики (различными буквами
обозначены варианты, имеющие значимые различия по критерию Дункана при p < 0,05)
Рис. 3. Влияние концентрации регуляторов роста на укореняемость княженики in vitro
(различными буквами обозначены варианты, имеющие значимые различия
по критерию Дункана при p < 0,05)
В исследовании установлены существенные различия по укореняемости микропобегов княженики на питательных средах с 0,3 мг/л и 0,5 мг/л ИУК. В свою очередь, укореняемость эксплантов при использовании 0,3 и 0,5 мг/л ИМК статистически не различалась. Максимальная укореняемость микропобегов отмечена при культивировании микропобегов на питательной среде с 0,5 мг/л ИУК (82 %). Культивирование сортов княженики на питательных средах с добавлением ИМК в различных концентрациях не оказало значительного влияния на образование корней у микропобегов: укореняемость составила 56–61 %. Таким образом, использование 0,5 мг/л ИУК для укоренения сортов княженики повышает эффективность метода клонального микроразмножения.
Заключение. В ходе исследования был оптимизирован протокол культивирования in vitro сортов Rubus arcticus. На этапе собственно микроразмножения оптимально использование питательной среды, сочетающей 6-БАП и ТДЗ в концентрациях 1,0 мг/л.
Укореняемость сортов княженики зависит от генотипа и концентрации регулятора роста в питательной среде. Наибольшим процентом укоренившихся микропобегов характеризовался сорт Sofia, оптимальным ауксином на этапе укоренения является ИУК в концентрации 0,5 мг/л.
1. Hellqvist S. Establishment of hybrid arctic bramble under field conditions // Acta Agriculturae Scandinavica, Section B-Plant Soil Science. 2000. Vol. 50 (3). P. 169–175.
2. Kallio H. Development of volatile aroma compounds in arctic bramble, Rubus arcticus L. // Journal of Food Science. 1976. Vol. 41. P. 563–566.
3. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Семейства Actinidiaceae – Malvaceae Euphorbiaceae – Haloragaceae / под ред. А.Л. Буданцева. СПб.; М.: КМК, 2009. Т. 2. 513 с.
4. Синельникова Н.В., Пахомов М.Н. Княженика (Rubus arcticus L.) в долине реки Колыма – сезонное развитие и плодоношение // Вестник КрасГАУ. 2023. №. 4. С. 100–105.
5. Яцына, А.А., Концевая И.И. Размножение и интродукция поляники (Rubus arcticus L.) в Беларуси // Плодоводство. 2004. Т. 15. С. 207–211.
6. Получение гаплоидных растений Rubus arcticus L. методом культуры микроспор in vitro / Д.Н. Зонтиков [и др.] // Сельскохозяйственная биология. 2020. Т. 55, № 1. С. 128–136.
7. Гудовских Ю.В., Егорова Н.Ю., Егошина Т.Л. Cостояние ценопопуляций Rubus arcticus (Rosaceae) в Кировской области // Ботанический журнал. 2020. Т. 105, № 8. С. 779–793.
8. Применение биотехнологических методов для сохранения генофонда редких видов растений / О.И. Молканова [и др.] // Ботанический журнал. 2020. T. 105, № 6. С. 610–619.
9. Kokko H. I., Kivineva M., Kärenlampi S.O. Single-step immunocapture RT-PCR in the detection of raspberry bushy dwarf virus // Biotechniques. 1996. Vol. 20(5) P. 842–846.
10. Зонтиков Д.Н., Зонтикова С.А., Малахова К.В. Влияние рH питательной среды на рост и развитие некоторых сортов Vaccinium angustifolium L. и Rubus arcticus L. при клональном микроразмножении // Труды Санкт-Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства. 2022. № 4. С. 31–41.
11. Макаров С.С., Кузнецова И.Б. Корнеобразование in vitro и адаптация ex vitro княженики арктической при клональном микроразмножении // Известия Оренбур. гос. аграр. ун-та. 2018. № 6 (74). С. 52–55.
12. Особенности регенерации перспективных сортов Actinidia arguta в культуре in vitro / Д.А. Семенова [и др.] // Таврический вестник аграрной науки. 2023. № 1 (33). С. 93–103.
13. Зонтиков Д.Н., Зонтикова С.А., Малахова К.В. Влияние состава питательных сред и регуляторов роста при клональном микроразмножении некоторых хозяйственно ценных представителей рода Rubus L. // Агрохимия. 2021. № 6. С. 36–42.
14. Бъядовский И.А. Влияние различных концентраций 6-бензиламинопурина и тидиазурона на коэффициент размножения клоновых подвоев яблони и груши в культуре in vitro // Плодоводство и ягодоводство России. 2013. Т. 37, № 1. С. 52–56.
15. Соловых Н.В. Клональное размножение in vitro малины душистой // Международный журнал гуманитарных и естественных наук. 2023. № 8–2 (83). С. 22–26.
