Россия
г Саратов, Россия
Дезинтегрированные мембраны Yersinia pseudotuberculosis (ДМ Y. pseudotuberculosis) являют-ся перспективными в антигенном плане препаратами. Цель исследования – изучение белкового и антигенного составов препарата ДМ Y. pseudotuberculosis. С помощью электрофореза было установлено преобладание в ДМ Y. pseudotuberculosis белков с молекулярными массами 23, 38 и 45 кДа, из которых в наибольшем количестве присутствовал белок массой 38 кДа. У мышей, иммунизированных препаратом ДМ Y. pseudotuberculosis, отмечалось усиление дыхательной ак-тивности перитонеальных макрофагов и антителогенеза. Скорость прироста дыхательной активности перитонеальных макрофагов снижалась при иммунизирующих дозах выше 63 мкг/мышь, а также замедлялось антителообразование, что определило величину иммунизиру-ющей дозы в 63 мкг/мышь. При пересчете на кролика массой 2,5 кг иммунизирующая доза со-ставила 2 мг. Нами также была проведена пятикратная иммунизация кроликов для получения высокоспецифических антител к ДМ Y. pseudotuberculosis. Титры антител полученной сыво-ротки в ИФА с цельными клетками Y. pseudotuberculosis составили 1:25600, с клетками Y. enterocolitica – 1:200, с клетками других представителей кишечной группы бактерий – 1:100–1:400. Это свидетельствует о том, что основной антигенной активностью в ДМ Y. pseudotuberculosis обладают белки с видовой специфичностью. Полученные антитела взаимо-действовали в иммуноблоттинге с белками ДМ, имеющими молекулярные массы 38, 45, 58, 66 кДа. Однако наиболее интенсивное взаимодействие отмечалось с белком молекулярной массы 45 кДа. При психрофильном культивировании иерсиний молекулярным массам обнаруженных нами белков соответствуют только термостабильный токсин и порины клеточной стенки. Данные антигены достаточно устойчивы к низким концентрациям додецилсульфата натрия и вместе с липополисахаридом могут составлять основную антигенную композицию ДМ Y. pseudotuberculosis, обладающую видовой специфичностью.
Yersinia pseudotuberculosis, дезинтегрированные мембраны, антигены, белки
Введение. Yersinia pseudotuberculosis (Y. pseudotuberculosis) поражает людей и животных. У животных псевдотуберкулез протекает без характерных клинических признаков с поражением желудочно-кишечного тракта или латентно, что требует применения лабораторной диагностики, в том числе серологической, предполагающей использование антительных и антигенных диагностических препаратов. Поэтому антигенный состав иерсиний достаточно неплохо изучен. Многочисленными исследованиями установлено, что возбудитель псевдотуберкулеза обладает соматическим S-антигеном, жгутиковым Н-антигеном, V- и W-антигенами, суперантигенным токсином (YPM), а также термостабильным токсином (ST) и белками наружной стенки иерсиний (Yops), обладающими антигенными свойствами.
S-антиген Y. pseudotuberculosis сходен по химическому составу, физическим свойствам и строению с О-антигеном кишечноиерсиниозного микроба. Он является токсичным липополисахариднопротеидным комплексом, используется в диагностике и образует 21 серовариант.
Н-жгутиковый антиген белковой природы у Y. pseudotuberculosis диагностического значения не имеет и разрушается перед постановкой серологических тестов кипячением бактериальной культуры.
V- и W-антигены имеются только у штаммов иерсиний, свежевыделенных из теплокровного организма или выращенных на питательных средах при температуре 37 °С. Они расположены в клеточной стенке, имеют белковую природу и встречаются у нескольких представителей рода [1, 2].
У энтеропатогенных иерсиний в клеточной стенке имеется белок инвазин с молекулярной массой 103 кДа. Максимальная продукция белка наблюдается при температуре 28–30 °С [3].
YPM – белок псевдотуберкулезного микроба с молекулярной массой 14,5 кДа, вызывает синтез антител у 61 % заболевших данной инфекцией людей [4].
Антитела к видоспецифическому токсину ST, представленному белком с молекулярной массой 45 кДа, также можно часто обнаружить у псевдотуберкулезных больных [5].
Yops – синтезируются только при 37 °С в отсутствии ионов Са2+ и встречаются у патогенных представителей рода иерсиний. К Yops относят: YopА (с молекулярной массой (м.м.) 200 кДа), YopВ (м.м. 42 кДа), YopD (м.м. 33 кДа), YopE (м.м. 23 кДа), YopH (м.м. 51 кДа), YopК (м.м. 21 кДа), YopМ (м.м. 42 кДа), YopN (м.м. 33 кДа) [3].
Антигенные видо- и родоспецифические свойства обнаружены у белков поринов иерсиний с молекулярной массой 38–40 кДа. Они осуществляют трансмембранный перенос питательных веществ и продуктов метаболизма микробных клеток [6].
Перспективными в антигенном плане, на наш взгляд, являются дезинтегрированные мембраны (ДМ) Y. pseudotuberculosis. Препарат ДМ был нами успешно использован для получения гипериммунных сывороток кролика [7].
Цель исследования – изучение белкового и антигенного составов препарата ДМ Y. Pseudotuberculosis.
Объекты и методы. Для выделения ДМ был использован музейный штамм Y. Pseudotuberculosis III О:3 сероварианта, взятый из коллекции патогенных микроорганизмов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Микроб культивировали на мясопептонном агаре в течение 2 сут при температуре 24 °С.
Для получения ДМ Y. pseudotuberculosis отмытую бактериальную взвесь обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе. Затем отделяли частично разрушенные клеточные мембраны от цитоплазмы и периплазмы центрифугированием. Полученные клеточные мембраны разрушали до молекул 20 ч при комнатной температуре 2 % раствором додецилсульфата натрия (SDS), от которого впоследствии освобождались диализом в проточной воде.
Состав белковых фракций исследовали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (SDS-PAGE) по Laemmli [8] в 12 % разделительном геле. Для обнаружения белков SDS-PAGE использовали окраску Кумасси синим R-250 (Merck, Германия).
Для определения иммунизирующей дозы вводили внутрибрюшинно белым мышам по 0,25 мл раствора ДМ Y. pseudotuberculosis в дозах: 500, 250, 125, 63, 31, 16 мкг/животное (по 3 мыши на дозу). К антигену добавляли 0,25 мл масляного адъюванта. Мышам 7-й группы инъецировали 0,01М фосфатный буферный раствор (отрицательный контроль). Масса мышей составляла 20–22 г. Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в 10 дней. Через 10 дней после второй иммунизации проводили декапитацию мышей с извлечением из брюшной полости перитонеальных макрофагов и взятием крови из перерезанных шейных сосудов.
Активность клеточного иммунитета у мышей определяли замером дыхательной активности перитонеальных макрофагов [9].
Активность гуморального иммунитета у мышей, а также специфичность полученной гипериммунной кроличьей сыворотки определяли по количеству антител методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на планшетах [10].
Иммунизацию кроликов проводили подкожно вдоль спины в 3–4 точки в объеме 1 мл смеси антигена и масляного адъюванта. При иммунизации соотношение адъюванта к раствору ДМ составляло 1:1. ДМ инъецировали кролику в количестве 2 мг. Было проведено 5 иммунизаций с интервалом в 2 недели. Кровь для исследования брали из ушной вены в объеме 5 мл через 14 суток после последней иммунизации [7].
Иммуноблоттинг проводили по методу Towbin [11] с использованием сыворотки, полученной к ДМ Y. pseudotuberculosis в разведении 1:200, а также конъюгата – антикроличьих антител, меченных пероксидазой (ИЭМ имени Н.Ф. Гамалеи РАМН).
Результаты и их обсуждение. Для определения спектра белков, входящих в состав ДМ Y. pseudotuberculosis (ДМ Y. p.), нами был проведен электрофорез препарата ДМ и лизата цельных клеток псевдотуберкулезного микроба (ЦК Y. p.). Результаты представлены на рисунке.
|
а |
|
б |
|
72 |
|
260 140 95 |
|
34 |
|
52 |
|
42 |
|
17 |
|
26 |
|
ЦК Y. е. |
|
260 |
|
140 |
|
95 |
|
72 |
|
52 |
|
42 |
|
34 |
|
26 |
|
17 |
|
10 |
|
ЦК Y. р. |
|
ДМ Y. р. |
|
ДМ Y. р. |
Изучение белкового состава ДМ Y. pseudotuberculosis:
а – электрофорез белков; б – иммуноблоттинг с сывороткой, полученной
к ДМ Y. pseudotuberculosis
Как видно из рисунка (а), бактериальная клетка имеет широкий спектр белков, однако в препарат ДМ входят только некоторые из них. В составе ДМ Y. pseudotuberculosis преобладают белки с молекулярными массами: 23, 38 и 45 кДа, в большем количестве содержится белок массой 38 кДа. Однако наличие данных белков не исключает присутствия в препарате и других белков в более низких количествах.
Для определения антигенной активности белков необходима иммунизация животных с последующим изучением ответной реакции клеточной и гуморальной подсистем иммунитета. Поэтому нами была проведена иммунизация белых мышей препаратом ДМ Y. Pseudotuberculosis. Изменения клеточного иммунитета у иммунизированных мышей определялись нами по дыхательной активности их перитонеальных макрофагов, выделяемых из брюшной полости. Гуморальный иммунитет изучался наблюдением изменений титров специфических антител в крови мышей. В связи с отсутствием информации о величине оптимальной иммунизирующей дозы ДМ Y. pseudotuberculosis для белых мышей нами было иммунизировано несколько групп животных разными дозами препарата (табл.).
Результаты иммунизации белых мышей ДМ Y. pseudotuberculosis
|
Иммунизирующая доза ДМ, мкг/мышь |
Концентрация формазана на 1 перитонеальный макрофаг, г |
Титры антител в ИФА с ДМ Y. pseudotuberculosis |
|
500 |
12,2·10-10 |
1 : 12800 |
|
250 |
11,6·10-10 |
1 : 12800 |
|
125 |
10,4·10-10 |
1 : 6400 |
|
63 |
8,7·10-10 |
1 : 6400 |
|
31 |
5,8·10-10 |
1 : 3200 |
|
16 |
3,0·10-10 |
1 : 1600 |
|
0 (контрольная) |
1,6·10-10 |
1 : 400 |
Как видно из данных, приведенных в таблице, ДМ Y. pseudotuberculosis способствуют значительной активизации клеточного и гуморального иммунитетов. Однако скорость прироста дыхательной активности перитонеальных макрофагов снижается при иммунизирующих дозах выше 63 мкг/мышь, а также замедляется антителообразование, что определяет величину иммунизирующей дозы в 63 мкг/мышь. При пересчете на кролика массой 2,5 кг иммунизирующая доза составит 2 мг [12].
Дальнейший этап предполагает исследование специфичности антител, полученных в результате иммунизации.
Известно, что высокая специфичность иммунных сывороток связана с наличием иммуноглобулинов класса G, которые в процессе иммунизаций постепенно вытесняют слабоспецифичные иммуноглобулины классов М и А. Данный процесс завершается к 5-й иммунизации.
Нами была проведена пятикратная иммунизация кролика ДМ Y. pseudotuberculosis дозой 2 мг/животное для получения гипериммунной сыворотки. Титры антител полученной сыворотки в ИФА с цельными клетками Y. Pseudotuberculosis составили 1:25600, с клетками Y. enterocolitica – 1:200, с клетками других представителей кишечной группы бактерий – 1:100–1:400. Это свидетельствует о том, что основной антигенной активностью в ДМ Y. Pseudotuberculosis обладают белки с видовой специфичностью [7].
Для определения масс наиболее активных в антигенном плане белков нами был проведен иммуноблоттинг, результаты которого представлены на рисунке (б). Как видно из рисунка, сыворотка, полученная к ДМ Y. Pseudotuberculosis, взаимодействовала в иммуноблоттинге с белками 38, 45, 58, 66 кДа, входящими в состав ДМ Y. pseudotuberculosis. Однако наиболее интенсивное взаимодействие отмечается с белком молекулярной массой 45 кДа.
Большое значение при получении нами ДМ Y. pseudotuberculosis имеет низкая температура культивирования бактерий. В психрофильных условиях микроб не продуцирует Yops, V- и W-антигены, антиген рН 6, поэтому данные белки не могут присутствовать в препарате ДМ. Из белков, которые мы можем обнаружить в ДМ Y. pseudotuberculosis, следует отметить инвазин [3], порины [6], YPM [4], ST [5]. Однако молекулярным массам обнаруженных нами белков соответствуют только ST и порины. Данные антигены достаточно устойчивы к низким концентрациям SDS и вместе с липополисахаридом могут составлять основную антигенную композицию ДМ Y. pseudotuberculosis, обладающую видовой специфичностью.
Заключение. Из полученных результатов следует, что в составе ДМ Y. pseudotuberculosis преобладают белки с молекулярными массами 23, 38 и 45 кДа. Однако наибольшее значение для образования антител в составе ДМ Y. pseudotuberculosis имеют белки с молекулярными массами 38, 45, 58, 66 кДа. Антитела, полученные к белкам ДМ Y. pseudotuberculosis, обладают видовой специфичностью. Кроме активизации антителогенеза белки ДМ Y. pseudotuberculosis способствуют значительной стимуляции клеточного иммунитета.
1. Зыкин Л.Ф., Щербаков А.А., Хапцев З.Ю. Иерсиниоз и псевдотуберкулез сельскохозяйствен-ных животных. Саратов, 2002. 67 с.
2. Псевдотуберкулез / И.А. Шурыгина [и др.]. Новосибирск: Наука, 2003. 320 с.
3. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002. № 3 (4). С. 248–266.
4. The superantigenic toxin of Y. pseudotuberculosis, a novel virulence factor? / C. Carnoy [et al.] // Int. J. Med. Microbiol. 2000. № 4-5 (290). P. 477–482.
5. Андрюков Б.Г., Недашковская Е.П., Тимченко Н.Ф. Опыт клинического использования видо-специфической иммуноферментной тест-системы для диагностики псевдотуберкулеза // Лаб. нов. Дальн. Вост. 1999. № 1. С. 3–4.
6. Использование порина наружней мембраны Yersinia enterocolitica для диагностики иерсиниоза с помощью ИФА / О.П. Вострикова [и др.]; Тихоокеанский ин-т биоорганической химии ДВО РАН (Владивосток) // Биологические мембраны. 2009. № 5 (26). С. 419–428.
7. The effect of polyazolidinammonium on the dynamics of the synthesis of pseudotuberculosis antibod-ies / S.V. Ivashchenko [et al.] // IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science. 2020. 421. 022055. DOI: 10.1088/ 1755-1315/421/2/022055.
8. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. № 22. P. 680–685.
9. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods. 1983. № 1-2 (65). P. 55–63.
10. Hornbeck P., Winston S.E., Fuller S.A. Enzyme-linked immunosorbent assays // Current Protocols in Molecular Biology. 2001. № 15. P. 2.1.1–2.1.23.
11. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: journal. 1979. № 9 (76). P. 4350–4354.
12. Выбор дозы препарата для доклинического исследования: межвидовой перенос доз / Е.В. Ше-кунова [и др.] // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2020. № 1 (10). С. 19–28.
