Введение. Картофель – наиболее распространенная пропашная культура, возделываемая сельскохозяйственными товаропроизводителями в Республике Коми [1, 2]. Аграрии региона предъявляют все большие требования к создаваемым в результате селекционного процесса сортам. Это вызвано многими факторами – глобальное изменение климата, распространение на территории республики болезней и вредителей, мигрировавших на север из южных регионов нашей страны, проявление все большей устойчивости различных фитопатогенов сельскохозяйственных культур к применяемым средствам химической защиты растений и успешное противостояние им и многое другое [3, 4, 5]. Все вышесказанное определяет основную задачу сегодняшней селекции – непрерывность и постоянное совершенствование самого процесса выведения новых перспективных сортов. На современном этапе наука позволяет провести подбор сортов и гибридов для каждого региона России в соответствии с его агроклиматическими и фитосанитарными особенностями [6]. В последние годы широкое распространение получил метод генетического скрининга на наличие генов, отвечающих за устойчивость к раку, золотистой и бледной картофельным нематодам (ЗКН и БКН), вирусам картофеля X, Y (ХВК и YВК) и другим болезням, в том числе карантинным, что позволяет на ранних этапах селекционного процесса отобрать наиболее предпочтительные гибриды [7, 8, 9].
Цель исследований – генетический скрининг и отбор перспективных селекционных гибридов картофеля, сочетающих устойчивость к комплексу фитопатогенов, для создания новых сортов, адаптированных к условиям Крайнего Севера.
Условия, материалы и методы. Материалом для исследования служили перспективные гибриды картофеля питомника размножения – 2341-265 (Амур × Гала), 2339-8 (Оксания × Гала), 2339-9 (Оксания × Гала), 1992-14 (Удача × Элмундо), 2000-60 (Колетте × FZ 1867). Определяли наличие 10 основных генов устойчивости к раку (Synchytrium endobioticum), золотистой картофельной нематоде (Globodera rostochiensis), бледной картофельной нематоде (Giobodera pallida), X-вирусу и Y-вирусу.
Оценивали наличие генов устойчивости картофеля к болезням и вредителям с использованием соответствующих маркеров (ген / маркер): Y вирус картофеля – Ryadg / RYSC3 [10], Ryсhc / Ry186 [11], Rysto / YES3-3A [12]; золотистая цистообразующая картофельная нематода – H1 / TG689 [13], H1 / 57R [14], H1 / N195 [11], Gro1-4 / Gro1-4-1 [15]; бледня картофельная нематода – Gpa2 / Gpa2-2 [11, 15]; рак картофеля – Sen1 / NL25 [16]; X вирус картофеля – Rx1 / PVX [11, 15].
ДНК выделяли из листьев растений, отобранных в межфазный период бутонизация–цветения со среднего яруса куста по одному листу с растения, методом органической экстракции (http://www.syntol.ru/catalog/prochie-reagenty-dlya-molekulyarnoy-biologii/nabor-genekspert-kartofel.html). Качество и количество выделенной ДНК оценивали спектрофотометрически на приборе NanoDrop ND-1000 (США).
Генотипирование ДНК картофеля проводили с использованием набора реагентов «ГенЭксперт «Картофель» («Синтол»), фрагментный анализ на наличие маркеров генов устойчивости картофеля – набора реагентов «ГенЭксперт «Маркеры генов устойчивости картофеля» («Синтол»). В качестве отрицательного контроля была выбрана вода деионизированная (ГОСТ 11.029.003-80), положительного – смесь десяти плазмид, содержащих искомые фрагменты ДНК картофеля с рассматриваемыми генами.
Для проведения ПЦР-анализа использовали термоциклер Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (США). Объем реакционной смеси – 23 мкл. В реакционную смесь добавляли по 2 мкл ДНК в концентрации 5…15 нг. После амплификации смешивали 1 мкл ПЦР-смеси, 9 мкл формамида и 1 мкл маркера молекулярного веса, в качестве которого использовали CД-600 (канал liz) производства фирмы «Синтол».
Режим амплификации включал следующие этапы: 1 цикл – денатурация при 95 °С, 5 мин.; 40 циклов – при 95 °С, 20 с, отжиг – при 61 °С, 30 с, элонгация – при 72 °С, 40 мин; 1 цикл – дорепликация при 72 °С, 1 мин.
Последующий процесс электрофореза исследуемого материала проводили на устройстве секвенирования ДНК Нанофор-05 (8-капиллярный), производства Института аналитического приборостроения РАН в соответствии с руководством и инструкцией по применению генетического анализатора (http://www.syntol.ru/information-support/instruktsii/). Анализ выполнения электрофореза, информация о детекции флуоресценции, идентификация аллелей проходили в автоматическом режиме. Информация передавалась на персональный компьютер и обрабатывалась на нем с помощью программы «ГенЭксперт» (версия 5.0.1.6).
На последнем этапе проводили проверку выполненного анализа с целью исключения получения ложноположительных данных согласно инструкции к набору «ГенЭксперт «Маркеры генов устойчивости картофеля» фирмы «Синтол». Определяли наличие или отсутствие пиков продуктов амплификации известной длины. При наличии пиков делали вывод о присутствии в исследуемом образце генов устойчивости к патогенам, при отсутствии – соответственно обратный вывод [17].
Результаты и обсуждение. В положительном контроле были определены все 10 выбранных для исследования маркеров генов устойчивости, тогда как в отрицательном контроле пики отсутствовали. Это позволило сделать вывод о точности проведенного анализа и отсутствии ложноположительных результатов.
По результатам анализа следует выделить гибрид картофеля 2341-265 и охарактеризовать его как не перспективный для проведения дальнейшей селекционной работы по выведению новых перспективных сортов в связи с выявлением у него только одного гена устойчивости к раку картофеля – Sen1 (NL25) (см. табл.).
Следует отметить гибрид 2339-8, несущий в своем генотипе, в отличие от остальных изучаемых образцов, оба гена, отвечающих за устойчивость к золотистой картофельной нематоде – гены H1 и Gro1-4, выявленные с использованием маркеров TG-689, 57R, N195 и Gro1-4-1 соответственно, а также гена устойчивости к раку картофеля – Sen1 (маркер NL25). Доминантная аллель гена Sen1, характеризующаяся особенностью к полной блокировке развития и репродукционной активности вида патогенных грибов S. endobioticum, выявлена у всех рассматриваемых гибридов. У гибридов 2339-9 и 2000-60 выявлены три маркера гена, кодирующих устойчивость к G. rostochiensis – H1 (TG-689, 57R, N195) и маркер гена к S. endobioticum – Sen1 (NL25).
Таблица – Результаты генотипирования исследуемых образцов*
|
RYSC3 |
Ry186 |
YES3-3A |
TG-689 |
57R |
N195 |
Gro1-4-1 |
Gpa2-2 |
NL25 |
PVX |
|
|
Ген |
Ryadg |
H1 |
Gro1-4 |
Sen1 |
Rx1 |
|||||
|
Устойчи-вость |
Y-вирус |
золотистая цистообразующая картофельная нематода |
Бледная картофельная нематода |
X-вирус |
||||||
|
2341-265 |
с/о |
с/о |
с/о |
с/о |
с/о |
с/о |
с/о |
с/о |
в |
с/о |
|
2339-8 |
с/о |
с/о |
с/о |
в |
в |
в |
в |
с/о |
в |
с/о |
|
2339-9 |
с/о |
с/о |
с/о |
в |
в |
в |
с/о |
с/о |
в |
с/о |
|
1992-14 |
с/о |
с/о |
с/о |
в |
в |
в |
с/о |
в |
в |
с/о |
|
2000-60 |
с/о |
с/о |
с/о |
в |
в |
в |
с/о |
с/о |
в |
с/о |
|
* – с/о – сигнал отсутствует, в – ген выявлен. |
||||||||||
Из всех рассматриваемых генотипов картофеля следует выделить гибрид 1992-14 в котором выявлено пять из десяти основных маркеров генетической устойчивости к патогенам, в том числе и к G. pallida – H1 (TG-689, 57R, N195), Gpa2 (Gpa2-2), Sen1 (NL25). Наличие гена устойчивости к G. pallida выделяет этот гибрид из всех рассматриваемых и делает его весьма перспективным для дальнейшего процесса селекции и выведения сортов, устойчивых к бледной картофельной нематоде в тех районах страны, в том числе и в Республике Коми, в которых этот патоген распространен.
У всех исследуемых генотипов не выявлены маркеры PVX гена Rx1 устойчивости к X-вирусу и маркеры к генам RYSC3 (Ryadg), Ry186 (Rychc), YES3-3A (Rysto) устойчивости к Y-вирусу. Это свидетельствует о необходимости включения в селекционный процесс новых перспективных генотипов, несущих гены устойчивости к этим вирусам.
Выводы. Проведенный молекулярно-генетический анализ наличия генов устойчивости к патогенам у перспективных гибридов картофеля позволил выделить ряд генотипов, обладающих конкурентными преимуществами над остальными, проходящими селекционные испытания в питомниках размножения. У образцов 2339-8 (Оксания × Гала) и 1992-14 (Удача × Элмундо) выявлено максимальное в выборке количество маркеров (по пять у каждого), сцепленных с генами устойчивости: у обоих гибридов – TG-689, 57R, N195 и NL25; у 2339-8 – еще определен маркер Gro1-4-1, а у 1992-14 – Gpa2-2. У одного селекционного номера 2341-265 (Амур × Гала) отмечен только маркер гена устойчивости к раку картофеля (Synchytrium endobioticum) – NL25. Образец 2339-8 можно характеризовать как ценный источник R-генов, несущий в своем геноме гены устойчивости к золотистой цистообразующей картофельной нематоде G. rostochiensis (H1, Gro1-4) и к раку картофеля Synchytrium endobioticum (Sen1). Генотип гибрида 1992-14 (Удача × Элмундо), несущий ген Gpa2, рекомендован для скрещивания и создания новых селекционных линий с целью выведения новых сортов картофеля, устойчивых к различным видам нематод (бледная картофельная нематода G. pallida).
