Введение. В последние годы в медицине огромное значение уделяют фитопрепаратам. Внимание учёных сосредоточено на растениях рода Thymus, эфирное масло которых применяют в качестве мочегонных, антиоксидантных, успокаивающих, жаропонижающих, а также противосудорожных лекарственных средств. Имеются сведения об использовании препаратов из этого растения в виде мазей и компрессов при болях в суставах, ревматизме и при кожных заболеваниях [1, 2]. В эфирном масле ряда видов Thymus содержится ценное фенольное соединение – тимол, которое обладает бактерицидным, противовирусным, противогрибковым и противовоспалительным действием [3, 4, 5]. Существуют научные исследования, в которых описывается применение тимьяна при нарушениях работы пищеварительной системы, а также как вспомогательное средство для выведения желчи [6]. Издавна известно использование настоев и отваров из растительного сырья тимьяна, как лекарственных средств, обладающих отхаркивающим и антисептическим действием. Поэтому их включают в терапии заболеваний дыхательной системы (бронхита, ларингита, ангины и трахеита) [7, 8].
В последние десятилетия все больше видов сельскохозяйственных растений размножают с привлечением приемов культуры in vitro, которые позволяют повысить эффективность традиционного размножения и получить растения, оздоровленные от грибных, бактериальных, а при использовании хемо- или термотерапии, и вирусных инфекций. Методы микроразмножения также необходимы при разработке биотехнологий депонирования растений в условиях in vitro [9, 10].
Для достижения эффективности процесса микроразмножения in vitro необходимо оптимизировать состав питательной среды для каждого этапа и подобрать оптимальные условия культивирования, такие как продолжительность цикла выращивания, тип культурального сосуда и другие факторы. При этом для каждого вида или даже сорта растения разрабатывают конкретную методику клонального размножения [11, 12].
При анализе литературных источников по микроразмножению видов рода Thymus не было выявлено данных о комплексном влиянии условий культивирования на морфогенетический потенциал эксплантов. Отсутствуют публикации о зависимости коэффициента размножения тимьяна in vitro от продолжительности цикла выращивания и типа культурального сосуда. Кроме того, описанные в научных работах результаты отечественных и зарубежных ученых, касающиеся состава регуляторов роста в питательной среде и других вопросов, довольно противоречивы [13, 14]. Экпланты T. sibthorpii, по данным авторов, необходимо культивировать на безгормональной питательной среде [15]. В большинстве публикаций отмечают, что наивысший коэффициент размножения достигается в вариантах, где питательная среда содержит цитокинины. Так, для T. pallidus необходимо добавление кинетина или аденина [16], для T. serpyllum – совместно БАП и кинетина [17], для Thymus vulgaris – изопентиладенина [18]. Применение существующих протоколов размножения тимьяна при работе с новыми видами или образцами затруднено из-за отсутствия унифицированных методических подходов.
Цель исследования – оценка влияния гормонального состава питательной среды и условий культивирования на морфогенез эксплантов двух видов рода Thymus для разработки методики микроразмножения in vitro.
Условия, материалы и методы. В ходе исследования в качестве исходных взяты растения тимьяна ползучего (Thymus serpullum L.) и тимьяна кавказского (Thymus caucasicus Willd.), которые были выращены в условиях закрытого грунта. Растения T. serpyllum получены из коллекции генофонда пряно-ароматических, эфиромасличных и лекарственных растений ФГБУН «НИИСХ Крыма» (УНУ № 507515), а T. caucasicus – из коллекции Южно-Уральского ботанического сада-института Уфимского федерального исследовательского центра РАН.
В ходе работы применены общепринятые методы культуры органов и тканей растений [10, 11]. Для введения в культуру in vitro использовали ранее оптимизированные для этих видов растений питательные среды Мурасиге и Скуга (МС) [19].
На этапе собственно микроразмножения в условиях ламинарного бокса проводили микрочеренкование полученных при введении in vitro побегов. Выделенные сегменты стебля с одним узлом длиной 8…10 мм выращивали на модификациях питательной среды МС (фактор А), с добавлением кинетина (Кин.), тидиазурона (ТДЗ), бензиламинопурина (БАП), индолилуксусной кислоты (ИУК), гибберелловой кислоты (ГК3) (Sigma, CША), 2 % сахарозы и 0,8 % агар-агара (Fujian Putian, Китай). Состав регуляторов роста в питательной среде был выбран на основании наших предварительных исследований микроразмножения тимьяна обыкновенного [20]. Для выращивания эксплантов использовали разные культуральные сосуды – пробирки (15×160 мм), стеклянные банки (200 мл) и колбы (200 мл), закрытые фольгой.
Культивирование осуществляли при +24…+26 °С, относительной влажности воздуха 70 % и освещенности 2…3 тыс. люкс с фотопериодом 16 часов. На 30-, 40-, 50-, 60- и 70-е сутки цикла выращивания анализировали различные параметры: длину и число микропобегов и корней, количество узлов на побеге, количество оводненных микропобегов и другие. Для расчета коэффициента размножения количество сформированных побегов умножали на число узлов на побеге.
Повторность эксперимента – 3-кратная, количество эксплантов в каждой повторности – 20. Изучение влияния факторов на различные параметры микроразмножения проведено с использованием 2-факторных лабораторных опытов. Для статистической обработки данных применяли методы вариационной статистики (пакет программ Microsoft Office, Excel 2010). В таблицах и на графиках представлены средние арифметические и их ошибки на 5 %-ном уровне значимости.
В отдельном заключительном эксперименте для определения доли влияния отдельных факторов на коэффициент размножения проведен дисперсионный анализ (с использованием программы Statistica 10.0) влияния 4 факторов: генотипа (2 вида тимьяна), состава питательной среды (6 вариантов среды МС), типа культурального сосуда (пробирки, колбы, банки), продолжительности цикла выращивания (30, 40, 50, 60, 70 сут).
Результаты и обсуждение. На втором этапе размножения in vitro на микрорастениях формировались пазушные и адвентивные побеги. На эффективность этого этапа влиял генотип, состав питательной среды, а также условия культивирования – тип используемого для выращивания сосуда и продолжительность цикла выращивания.
Состав питательной среды. При сравнении числа побегов на 1 эксплант на питательных средах разного гормонального состава выявлен рост величины этого параметра у T. serpullum при культивировании на среде МС, содержащей 1,0 мг/л БАП или 1,0 мг/л ТДЗ (рис. 1а), по сравнению со средами с добавлением кинетина. У T. caucasicus отмечено достоверное повышение числа побегов при использовании безгормональной среды МС или введении в состав питательной среды кинетина, по сравнению с добавлением БАП или ТДЗ.
Анализ зависимости длины побега (рис. 1б) от типа и содержания регуляторов роста в питательной среде МС выявил, что максимального значения этот показатель у обоих видов достигал при использовании 1,0 мг/л кинетина. Применение в качестве цитокинина БАП или ТДЗ способствовало снижению длины микропобегов в 2,4…4,8 и 2,4…2,7 раза, по сравнению с кинетином, соответственно.
Рис. 1 – Количество (а) и длина побегов (б) при микроразмножении двух видов тимьяна на различных питательных средах.
Для T. caucasicus оптимальной оказалась среда МС с добавлением кинетина в количестве 1,0 мг/л. Так, на этой среде при оптимальных условиях культивирования коэффициент размножения достигал 16,1.
При использовании БАП или ТДЗ у T. caucasicus наблюдали образование витрифицированных микропобегов с частотой от 41,3 до 49,3 % (табл. 1). Полученные результаты указывают на нерациональность применения указанных регуляторов роста для этого вида.
Таблица 1 – Коэффициент размножения и частота витрификации побегов 2-х видов тимьяна в зависимости от состава питательной среды
|
Регуляторы роста в среде МС, мг/л |
Коэффициент размножения |
Частота витрификации, % |
||
|
T. caucasicus |
T. serpullum |
T. caucasicus |
T. serpullum |
|
|
МС без гормонов |
13,5±1,5 |
3,0±0,3 |
0 |
0 |
|
Кин. – 1,0 |
16,1±1,6 |
6,0±0,5 |
0 |
0 |
|
Кин. – 1,0; ГК3 – 1,0 |
14,4±2,0 |
6,0±0,4 |
11,2±1,3 |
0 |
|
Кин –1,0; ИУК–0,5 |
13,5±1,5 |
3,0±0,3 |
0 |
0 |
|
БАП –1,0 |
2,3±0,3 |
6,7±0,6 |
49,3±5,1 |
0 |
|
БАП–1,0; ГК₃ –1,0 |
4,5±0,3 |
6,2±0,6 |
78,3±7,1 |
21,2±2,3 |
|
БАП–1,0; ИУК–0,5 |
2,5±0,3 |
4,8±0,6 |
67,7±6,1 |
8,2±0,9 |
|
ТДЗ – 1,0 |
4,6±0,3 |
6,8±0,5 |
41,3±4,8 |
56,3±6,2 |
|
ТДЗ–1,0; ГК₃ –1,0 |
5,4±0,5 |
9,6±0,5 |
82,4±8,8 |
82,6±7,3 |
|
ТДЗ–1,0; ИУК–0,5 |
4,2±0,3 |
6,8±0,5 |
59,6±5,8 |
56,3±6,2 |
При выращивании эксплантатов T. serpyllum отмечены значительные коэффициенты размножения (от 6,8 до 9,6) при использовании сред с тидиазуроном. Однако применение этого цитокинина как и в случае с T. caucasicus вызывало аналогичные нежелательные проявления в асептической культуре (витрификацию побегов от 56,3 до 82,6 %). В связи с этим мы рекомендуем воздержаться от использования этих сред для T. serpyllum.
У тимьяна ползучего на среде МС с 1,0 мг/л БАП оводненные побеги не формировались и коэффициент размножения достигал максимального значения – 6,7. Поэтому мы считаем эту среду оптимальной для микрораразмножения T. serpyllum.
Культуральный сосуд. Для оценки влияния условий культивирования на этапе собственно микроразмножения экспланты культивировали в пробирках, колбах и банках. Анализ представленных на рис. 2 данных показал, что количество побегов на 1 эксплант в банках было в 2,0…3,7 раза выше, по сравнению с культивированием в пробирках или колбах, на оптимальных для каждого вида тимьяна питательных средах. При добавлении в среду МС ТДЗ величина этого показателя была на одном уровне при использовании всех трех анализируемых типов культуральных сосудов.
Рис. 2 – Количество побегов на 1 эксплант в зависимости от культурального сосуда и состава регуляторов роста в питательной среде при микроразмножении двух видов тимьяна.
У T. сaucasicus в банках наблюдали меньше узлов на питательных средах с кинетином или БАП, по сравнению с культивированием в пробирках или колбах (рис. 3, 4). При этом у T. serpyllum отмечена тенденция повышения величины этого показателя при использовании банок.
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
Рис. 3 – Культивирование T. serpyllum (а – банки; б – колбы; в – пробирки) и T. сaucasicus (г – банки; д – колбы; е – пробирки).
Рис. 4 – Количество узлов на побеге в зависимости от культурального сосуда и состава регуляторов роста в питательной среде при микроразмножении двух видов тимьяна.
Анализ изменения коэффициента размножения в зависимости от типа культурального сосуда показал значительное его повышение при использовании банок (рис. 5). Так, при культивировании эксплантов на оптимальной питательной среде с кинетином в банках коэффициент размножения был выше у T. caucasicus в 1,4…1,9 раза, а у T. serpullum в 2,0…2,1 раза, по сравнению с пробирками или колбами.
Рис. 5 – Коэффициент размножения двух видов тимьяна в зависимости от культурального сосуда и состава регуляторов роста в питательной среде.
Продолжительность цикла выращивания. В нашими предыдущих исследованиях с Т. vulgaris показано, что при увеличении длительности цикла выращивания до 70 сут. коэффициент размножения возрастал в 3,2 раза, по сравнению со стандартным циклом (40 сут.) [20]. У T. caucasicus и T. serpullum при культивировании эксплантов более двух месяцев также происходило повышение коэффициента размножения в 1,3 и 1,8 раза, однако достоверных различий при сравнении циклов выращивания разной длительности не установлено.
Рис. 6 – Коэффициент размножения двух видов тимьяна в зависимости от продолжительности цикла выращивания in vitro.
Генотип. В ходе изучения клонального микроразмножения было выявлено, что влияние таких лимитирующих факторов, как состав питательной среды и условия культивирования, проявлялось по-разному у изученных видов тимьяна. Более высокий коэффициент размножения отметили у T. caucasicus. При сочетании оптимальных условий этот параметр достигал 16,1 (см. табл. 1). При культивировании T. serpullum коэффициент размножения был в 2,4…2,5 раза ниже.
Согласно результатам дисперсионного анализа 4-факторного лабораторного эксперимента, на величину наиболее важного параметра «коэффициент размножения» наибольшее влияние оказывали тип культурального сосуда (доля влияния 25,3 %), питательная среда (20,0 %), а также взаимодействие факторов «генотип» и «питательная среда» (20,8 %) (рис. 7).
Рис. 7 – Доля влияния генотипа, питательной среды, культурального сосуда и длительности цикла выращивания на коэффициент размножения тимьяна.
Доля влияния генотипа на коэффициент размножения T. caucasicus и T. serpullum составляла 10,6 %, а продолжительности культивирования в цикле выращивания ‒ всего лишь 3,8 %, или была несущественной.
Выводы. Максимальный в экспериментах коэффициент размножения T. caucasicus (16,1) отмечен при добавлении в питательную среду 1,0 мг/л кинетина, T. serpullum (6,7) – при добавлении 1,0 мг/л БАП. Наиболее эффективным было выращивание эксплантов тимьяна in vitro в стеклянных банках, которое обеспечивало повышение коэффициента размножения в 1,4…2,1 раза, по сравнению с использованием пробирок или колб. При микроразмножении T. caucasicus и T. serpullum целесообразно использовать стандартный цикл выращивания 40 суток. Коэффициент размножения тимьяна в наибольшей степени зависел от типа культурального сосуда (доля влияния 25,3 %), состава питательной среды (20,0 %) и взаимодействия генотипа и состава питательной среды (20,8 %).
