Цель исследования – оценка эффективности применения разработанного протокола проведения MLVA для дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза. Данный протокол вклю¬чает в себя анализ 15 VNTR-локусов с использованием модифицированных MLVA-праймеров. Для in vitro апробации предложенной MLVA схемы использовали выделенную нами ранее ДНК штаммов B. canis RM 6/66, B. suis 1330, B. suis 183-L, B melitensis 1565. MLVA проводили методом ПЦР с последующим разделением ампликонов в агарозном геле. Положительная амплификация наблюдалась для 10 из 15 VNTR-локусов, а именно Bru6, Bru7, Bru9, Bru16 и Bru18, Bru19, Bru21, Bru30, Bru43 и Bru45. Молекулярный размер данных локусов для референтных штаммов B. canis RM 6/66 и B. suis 1330 подтвердили in silico. Также представлены результаты MLVA для штаммов, представленных в базе данных GenBank. Путем поисковых запросов баз данных ресурсов NCBI нами были получены геномные последовательности 49 штаммов бруцелл видов B. canis, B. suis, B. aborus, B melitensis. C помощью биоинформационного анализа для данных штаммов определили молекулярную массу каждого из десяти VNTR-локуса и количество повторов в нем. По результатам проведенного MLVA построили дендрограмму. На основании филогенетического анализа последовательностей десяти вариабельных локусов установлено, что большинство исследуемых штаммов бруцелл распределились на дендрограмме в соответствии с их таксономическим положением. Таким образом заключили, что предложенный нами MLVA-протокол имеет потенциал использования для дифференциации штаммов бруцелл.
Brucella, MLVA, ПЦР, филогенетический анализ, тандемные повторы, бруцеллез
Введение. Бруцеллез – опасное заболевание животных и человека, распространенное преимущественно в странах с интенсивным животноводством [1]. К бруцеллезу восприимчивы все виды теплокровных животных, но чаще всего данное заболевание встречается у крупного рогатого скота, свиней, оленей, коз, овец, лошадей и собак. В России эпидемиологическая ситуация по данному заболеванию также характеризуется как достаточно напряженная [2]. В частности, основная часть случаев заболеваемости регистрируется на территориях Северо-Кавказского, Южного и Сибирского федеральных округов, в которых отмечается самая высокая заболеваемость крупного рогатого скота (более 80 % от общего количества больных животных в РФ) и мелкого рогатого скота (более 90 %) [3]. Эпидемическую ситуацию по бруцеллезу осложняет возможность вспышечной заболеваемости людей данным заболеванием [4]. Для человека наиболее патогенными считаются виды B. melitensis, B. abortus, B. suis и B. canis, заражение которыми может происходить при непосредственном контакте с инфицированными животными или при употреблении в пищу непастеризованных продуктов животного происхождения [5]. Необходимость применения современных молекулярно-генетических методов для проведения точной идентификации и типирования возбудителей бруцеллеза не вызывает сомнений. В частности, для молекулярного типирования возбудителей особо опасных инфекций успешно используется MLVA (Multiple Loci VNTR Analysis), представляющий собой сравнительный анализ вариабельности областей генома (VNTR-локусов), содержащих тандемные повторы [6]. Что касается бруцелл, данный метод отражает генетический полиморфизм у штаммов Brucella sp. и позволяет не только проводить внутривидовую дифференциацию, но и группировать штаммы возбудителей бруцеллеза в соответствии с их географическим происхождением [7, 8]. Ранее в качестве метода генотипирования бруцелл нами был предложен MLVA протокол, включающий в себя анализ 15 VNTR-локусов, содержащих тандемные повторы от 6 до 134 п. н. [9]. Принципиальным отличием данного подхода от других существующих схем исследования геномного полиморфизма бруцелл является использование оригинальной системы VNTR-праймеров, представляющих собой претерпевшие редизайн традиционно применяемые для MLVA олигонуклеотидные затравки. Однако отметим, что ранее нами был выполнен только теоретический подбор праймеров и необходимых условий ПЦР.
Цель исследования – оценка эффективности применения разработанного протокола проведения MLVA для дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза.
Материалы и методы. В работе использовали данные о геномных последовательностях 49 штаммов бруцелл, представленных в базе данных GenBank (табл. 1). Биоинформационный анализ проводили с помощью программ Vector NTI 9.1 и онлайн-ресурсов NCBI (URL: https://ncbi.gov).
Таблица 1
Использованные в работе штаммы бруцелл из базы данных GenBank
|
Штамм |
Географическое происхождение |
Номер в базе данных GenBank |
|
1 |
2 |
3 |
|
Brucella canis strain RM6/66 |
Коллекция (США) |
CP007758.1, CP007759.1 |
|
Brucella canis strain FDAARGOS_420 |
CP023974.1, CP023973.1 |
|
|
Brucella canis ATCC 23365 |
CP000872.1, CP000873.1 |
|
|
Brucella canis str. Oliveri |
HG803175.1, HG803176.1 |
|
|
Brucella canis strain 2010009751 |
США (Массачусетс) |
CP016977.1, CP016978.1 |
|
Brucella canis strain 2009013648 |
США (Аризона) |
CP016975.1, CP016976.1 |
|
Brucella canis strain 2009004498 |
США (Луизиана) |
CP016973.1, CP016974.1 |
|
Brucella canis strain SVA13 |
Швеция |
CP007629.1, CP007630.1 |
|
Brucella canis HSK A52141 |
Корея |
CP003174.1, CP003175.1 |
|
Brucella canis strain GB1 |
Китай |
CP027643.1, CP027642.1 |
|
Brucella suis 1330 |
Коллекция (США) |
AE014291.4, AE014292.2 |
|
Brucella suis bv. 1 strain CVI_59 |
Хорватия |
CP054959.1, CP054960.1 |
|
Brucella suis bv. 1 strain CVI_58 |
CP054961.1, CP054962.1 |
|
|
Brucella suis bv. 1 str. S2 |
Китай |
CP006961.1,CP006962.1 |
|
Brucella suis bv. 2 strain CVI_50 |
Хорватия |
CP054963.1, CP054964.1 |
|
Brucella suis bv. 2 strain Bs364CITA |
Португалия |
CP007697.1, CP007698.1 |
|
Brucella suis bv. 2 strain PT09172 |
CP007693.1, CP007694.1 |
|
|
Brucella suis bv. 3 str. 686 |
Коллекция (США) |
CP007719.1, CP007718.1 |
|
Brucella suis bv. 3 strain CVI_71 |
Хорватия |
CP054957.1, CP054958.1 |
|
Brucella suis bv. 4 strain CVI_72 |
CP054955.1,CP054956.1 |
|
|
Brucella suis bv. 5 strain CVI_73 |
CP054953.1,CP054954.1 |
|
|
Brucella melitensis bv. 1 str. 16M |
Коллекция (США) |
AE008917.1, AE008918.1 |
|
Brucella melitensis bv. 2 str. 63/9 |
CP007789.1, CP007788.1 |
|
|
Brucella melitensis strain 2008724259 |
США (Калифорния) |
CP016983.1, CP016984.1 |
|
Brucella melitensis strain CIIMS-NV-1 |
Индия |
CP029756.1, CP029757.1 |
|
Brucella melitensis strain BL |
Китай |
CP022875.1, CP022876.1 |
|
Brucella melitensis strain B15 |
CP035795.1, CP035796.1 |
|
|
Brucella melitensis M5-90 |
CP001851.1, CP001852.1 |
|
|
Brucella melitensis strain CIT21 |
CP025819.1, CP025820.1 |
|
|
Brucella melitensis strain C-573 |
Россия (Ставрополь) |
CP019679.1, CP019680.1 |
|
Brucella melitensis BwIM_SYR_04 |
Сирия
|
CP018512.1, CP018513.1 |
|
Brucella melitensis BwIM_SYR_26 |
CP018526.1, CP018527.1 |
|
|
Brucella melitensis BwIM_IRN_28 |
Иран |
CP018484.1, CP018485.1 |
Окончание табл. 1
|
1 |
2 |
3 |
|
Brucella melitensis BwIM_IRQ_32 |
Ирак |
CP018490.1, CP018491.1 |
|
Brucella melitensis BwIM_TUR_38 |
Турция |
CP018552.1, CP018553.1 |
|
Brucella melitensis BwIM_ITA_55 |
Италия |
CP018496.1, CP018497.1 |
|
Brucella abortus 2308 |
Коллекция (США) |
AM040264.1, AM040265.1 |
|
Brucella abortus biovar 1 str. 9-941 |
AE017223.1, AE017224.1 |
|
|
Brucella abortus bv. 2 str. 86/8/59 |
CP007765.1, CP007764.1 |
|
|
Brucella abortus bv. 6 str. 870 |
CP007709.1, CP007710.1 |
|
|
Brucella abortus 104M |
Китай |
CP009625.1, CP009626.1 |
|
Brucella abortus strain clpP |
CP044338.1, CP044339.1 |
|
|
Brucella abortus strain MC |
CP022879.1, CP022880.1 |
|
|
Brucella abortus strain CIIMS-NV-4 |
Индия |
CP025743.1, CP025744.1 |
|
Brucella abortus strain IVRI95 |
CP034695.1, CP034696.1 |
|
|
Brucella abortus strain 69841 |
Италия |
CP098117.1, CP098118.1 |
|
Brucella abortus strain 24157 |
CP098085.1, CP098086.1 |
|
|
Brucella abortus A13334 |
Южная Корея |
CP003176.1, CP003177.1 |
|
Brucella abortus strain 68 |
Украина (Луганск) |
CP066175.1, CP066176.1 |
Множественное выравнивание выполнили с использованием алгоритма MUSCLE в программе Mega 11. Филогенетический анализ осуществляли методом попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (UPGMA). Для оценки достоверности филогенетических связей использовали многократную генерацию методом Bootstrap для 1000 независимых построений каждого филогенетического дерева.
Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали выделенную нами ранее ДНК штаммов B. canis RM 6/66, B. suis 1330, B. suis 183-L и B melitensis 1565 [10, 11]. Амплификацию VNTR-локусов проводили согласно протоколу, представленному в работе Хаммадова с соавт. [9]. Полученные ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием. Визуализацию проводили с помощью UV-трансиллюминатора. Размер полученных фрагментов определяли с использованием программы «Gel Analyzer» путем сравнения фрагмента с маркером молекулярной массы ДНК «100 + bp DNA Ladder» (ЗАО «Евроген», Москва).
Результаты и их обсуждение. В рамках текущего исследования провели апробацию разработанного нами ранее MLVA-подхода с использованием ДНК бактерий B. canis RM 6/66, B. suis 1330, B. suis 183-L и B. melitensis 1565, а также нуклеотидных последовательностей бруцелл, представленных в базе данных GenBank. На первом этапе работы определили размеры получаемых VNTR-локусов штаммов B. canis RM 6/66, B. suis 1330, B. suis 183-L и B. melitensis 1565 с помощью ПЦР и последующего электрофореза. Результаты проведенного молекулярно-генетического анализа представлены в таблице 2.
Таблица 2
Характеристика VNTR-локусов исследуемых штаммов бруцелл
|
Локус |
Молекулярный размер локуса, п.н. |
|||
|
B. canis RM 6/66 |
B. suis 1330 |
B. suis 183-L |
B. melitensis 1565 |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
4 |
|
Bru4 |
– |
– |
– |
– |
|
Bru6 |
273 |
273 |
273 |
273 |
|
Bru7 |
165 |
165 |
165 |
157 |
|
Bru8 |
– |
– |
– |
– |
|
Bru9 |
160 |
144 |
160 |
152 |
|
Bru10 |
– |
– |
– |
– |
Окончание табл. 2
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Bru11 |
– |
– |
– |
– |
|
Bru16 |
168 |
168 |
160 |
152 |
|
Bru18 |
146 |
138 |
166 |
138 |
|
Bru19 |
170 |
164 |
184 |
178 |
|
Bru21 |
175 |
175 |
159 |
167 |
|
Bru30 |
129 |
129 |
121 |
185 |
|
Bru43 |
163 |
163 |
151 |
175 |
|
Bru43 |
188 |
188 |
134 |
152 |
Поскольку амплификация локусов Bru4, Bru8, Bru10, Bru11 и Bru55 для используемых штаммов была отрицательной, данные локусы были исключены из дальнейшей работы. Штаммы B. canis RM 6/66 и B. suis 1330 использовали в качестве референтных. Геном данных бактерий полностью секвенирован и представлен в базе данных GenBank, поэтому для B. canis RM 6/66 и B. suis 1330 с помощью биоинформационного анализа подтвердили размер оставшихся в работе десяти VNTR-локусов, после чего путем экстраполяции также определили точный молекулярный размер данных локусов для штаммов B. suis 183-L и B. melitensis 1565.
На следующем этапе работы провели MLVA для 49 штаммов бруцелл, представленных в базе данных GenBank (см. табл. 1). Для этого с помощью программы Vector NTI 9.1 нуклеотидные последовательности I и II хромосом бруцелл ограничили разработанными для аплификации VNTR-локусов праймерами, после чего определили молекулярный размер соответствующего VNTR-локуса и количество повторов в нем. Далее построили дендрограмму, представленную на рисунке.
Установили, что штаммы B. canis распределились на дендрограмме по трем близкородственным кластерам, два из которых являются общими с представителями вида B. suis. В частности, самый большой кластер сформирован штаммами B. canis и B. suis (I, IV биовара), располагающимися на соседних ветках, но выходящими из разных узлов. Штамм B. canis GB1, в свою очередь, сгруппировался вместе с кладой, состоящей из двух штаммов B. suis III биовара. Данный факт свидетельствует о генетическом родстве видов B. canis и B. suis, что находит подтверждение в исследованиях отечественных и зарубежных авторов [8, 11, 12]. Что касается остальных использованных штаммов B. suis, представители II биовара данного вида сгруппировались на дендрограмме в виде клады и близкородственной к ней ветви филогенетического древа. Обособленное положение также занял штамм B. suis V биовара, что согласуется с данными литературы о таксономии бруцелл [8]. Также родственную, но удаленную от других штаммов B. suis ветвь образует штамм B. suis 183-L, использованный в исследовании для апробации MLVA-подхода.
Другой тест-штамм – B. melitensis 1565 – сгруппировался в отдельную кладу с референтным штаммом B. melitensis 16М. Штаммы B. melitensis из базы данных GenBank образуют на дендрограмме три общих c представителями вида B. abortus кластера и группируются согласно их видовой принадлежности. В частности, штаммы B. abortus А13334, 68, IVRI95, 69841, 9-941 и CIIMS-NV-4 объединены в одну подгруппу внутри самого большого кластера, остальная часть которого представлена штаммами B. melitensis различного географического происхождения.
Штаммы B. abortus 86/8/59 и 104М образуют самостоятельную кладу, выходящую из общего узла со штаммами B. melitensis B15, M5-90, Bwl V IRQ 32. Аналогичным образом в другом кластере расположились штаммы B. abortus 870 и МС. Отдельно расположился кластер, сформированный коллекционным штаммом B. abortus 2308 и кладой, представленной изолятами из Китая (B. abortus clP) и Италии (B. abortus 24157).
Дендрограмма, иллюстрирующая кластеризацию исследованных штаммов бруцелл на основании проведенного MLVA-анализа (черными кругами обозначены штаммы, для которых VNTR-профиль определен in vitro; белыми – референтные штаммы)
Заключение. Проведенный по десяти вариабельным локусам MLVA-анализ позволяет систематизировать большинство использованных из базы данных GenBank штаммов бруцелл в соответствии с их таксономическим положением. Из чего можно сделать вывод, что данный подход к MLVA-типированию может быть использован для дифференциации представителей рода Brucella при проведении эпизоотологических расследований вспышек бруцеллеза.
1. Анализ заболеваемости людей бруцеллезом и молекулярно-биологическая характеристика изолятов Brucella melitensis на длительно неблагополучных по бруцеллезу терри¬ториях юга европейской части России / А.А. Хачатурова [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022. 99(1). С. 63–74. DOI: 10.36233/ 0372-9311-185.
2. Салмаков К.М., Косарев М.А. Совершенствование системы специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота с применением вакцины из штамма B. abortus 82 и препарата из штамма B. abortus R-1096 // Ветеринария. 2023. № 8. С. 9–13. DOI:https://doi.org/10.30896/0042-4846.2023.26.8.09-13.
3. Прошлое, настоящее, перспективы и проблемы совершенствования специфической профилактики бруцеллеза / В.А. Коршенко [и др.] // Медицинский вестник Юга России. 2021.№ 12 (3). С. 12–21. DOI: 10.21886/ 2219-8075-2021-12-3-12-21.
4. Анализ заболеваемости бруцеллезом и молекулярно-генетическая характеристика популяции бруцелл на территории Российской Федерации / Д.Г. Пономаренко [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2023. № 2. С. 61–74. DOI:https://doi.org/10.21055/0370-1069-2023-2-61-74.
5. In vitro antimicrobial susceptibility testing of human Brucella melitensis isolates from Qatar between 2014-2015 / A. Deshmukh [et al.] // BMC Microbiol. 2015. № 15 (121). DOI:https://doi.org/10.1186/s12866-015-0458-9.
6. Дифференциация штаммов Bacillus anthra-cis методом анализа температур плавления продуктов ПЦР, полученных после амплификации VNTR локусов / Н.А. Фахрутдинов [и др.] // Ветеринарный врач. 2023. № 2. С. 41–46. DOI:https://doi.org/10.33632/1998-698X_2023_ 2_41.
7. Изучение генетического разнообразия штам¬мов бруцелл, выделенных в Северо-Кавказском федеральном округе / И.В. Кузнецова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2017. № 3. C. 58–62. DOI:https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-58-62.
8. Кулаков Ю.К., Цирельсон Л.Е., Желудков М.М. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов бруцелл, выделенных от собак и оленей в различных регионах России // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012. № 4. С. 28–33. DOI:https://doi.org/10.3103/S0891416812040052.
9. Маркерные локусы генома бруцелл для дифференциальной ПЦР индикации патогенных штаммов / Н.И. Хаммадов [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2018. № 3. С. 88–93. DOI:https://doi.org/10.21055/0370-1069-2018-3-88-93.
10. Использование кривых плавления ампликонов VNTR-локусов для идентификации бруцелл / Е.А. Анисимова [и др.] // Перспективы развития современной ветеринарной науки: сб. науч. тр. по итогам Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 55-ле¬тию Прикаспийского зонального научно-исследовательского ветеринар. ин-та – филиала ФГБНУ «ФАНЦ РД» (22–23 сентября 2022 г.). Махачкала: Алеф, 2022. С. 22–26.
11. Применение HRM-анализа кривых плавления, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл / Е.А. Анисимова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2023. № 4. С. 42–49. DOI:https://doi.org/10.21055/0370-1069-2023-4-42-49.
12. Genetic and Phenotypic Characterization of the Etiological Agent of Canine Orchiepidi-dymitis Smooth Brucella sp. BCCN84.3 / C. Guzmán-Verri [et al.] // Front. Vet. Sci. 2019. № 6 (175). DOI:https://doi.org/10.3389/fvets.2019.00175.
