Россия
Россия
Красноярский край, Россия
Россия
Россия
Россия
Цель исследования – демонстрация возможностей многомерных статистических методов для сокращения трудоемкости выбора штаммов-антагонистов для биологической защиты сельскохозяйственных растений от болезней на примере поиска штаммов-антагонистов против грибных болезней рапса (Brassica napus). Методом встречных культур была изучена антибиотическая активность 9 штаммов Bacillus spp. и 1 штамма Streptomyces hygroscopicus в отношении 9 штаммов Fusarium spp., 2 штаммов Alternaria spp. и 2 штаммов Sclerotinia sclerotiorum, являющихся возбудителями грибных болезней рапса. В качестве показателя использована ширина зоны подавления роста. Методами дискриминантного анализа установлено, что штаммы бактерий-антагонистов статистически значимо (p < 0,001) различаются по спектру антибиотической активности в отношении фитопатогенных грибов, а штаммы фитопатогенных грибов, в свою очередь, статистически значимо (p < 0,001) различаются по спектру чувствитель¬ности к штаммам бактерий-антагонистов. Была построена матрица корреляций между чувствительностью разных штаммов фитопатогенных грибов к набору штаммов-антагонистов. Факторный анализ этой матрицы корреляций показал, что варьирование набора изученных штаммов фитопатогенных грибов по чувствительности к набору штаммов-антагонистов на 80,3 % объясняется действием двух факторов с собственными значениями выше 1. На основе факторных нагрузок был сделан вывод, что фактор 1 представляет собой антибиотические вещества, активные в отношении Fusarium spp., а фактор 2 – антибиотические вещества, активные в отношении Alternaria spp. и S. sclerotiorum. Это позволило сократить число тест-культур для поиска будущих антагонистов до 2 штаммов фитопатогенных грибов, имеющих максимальные факторные нагрузки соответственно по фактору 1 и фактору 2. Это также позволило оптимизировать комбинирование штаммов-антагонистов для создания будущих биопрепаратов, комбинируя штаммы с максимальным значением фактора 1 со штаммами с максимальным значением фактора 2.
Brassica napus, грибные болезни, Fusarium spp., Alternaria spp., Sclerotinia sclerotiorum, биологическая защита, штаммы-антагонисты
Введение. Одним из наиболее перспективных направлений в защите растений от болезней в настоящее время является биологический метод, основанный на интродукции в ризосферу или филлосферу штаммов, проявляющих антагонизм в отношении возбудителей болезней [1]. При сопоставимой с химическими препаратами цене и эффективности, биопрепараты на основе штаммов-антагонистов являются безопасными для окружающей среды и здоровья человека, а также снижают вероятность появления резистентности у фитопатогенных микроорганизмов. Главным препятствием к широкому распространению биологического метода в растениеводстве является крайне ограниченная номенклатура коммерческих биопрепаратов, связанная в первую очередь с недостаточным числом эффективных штаммов-антагонистов. В этой связи поиск таких штаммов, а также их комбинаций, является в высшей степени актуальной задачей [2]. Поскольку поиск штаммов-антагонистов для биологической защиты растений от болезней начинается с лабораторной оценки их антибиотической активности в отношении фитопатогенных микроорганизмов, встает проблема выбора тест-культур для проведения такой оценки. Предназначенный для использования в биопрепарате штамм-антагонист должен защищать растение от широкого спектра таксономически различающихся возбудителей. Однако проверка потенциальных штаммов-антагонистов на всем наборе возбудителей болезней соответствующей сельскохозяйственной культуры является трудоемкой задачей.
Цель исследования – демонстрация возможностей многомерных статистических методов для сокращения трудоемкости выбора штаммов-антагонистов для биологической защиты сельскохозяйственных растений от болезней на примере поиска штаммов-антагонистов против грибных болезней рапса (Brassica napus).
Объекты и методы. Объектами исследования служили 9 штаммов р. Bacillus и 1 штамм р. Streptomyces, выделенные авторами из сельскохозяйственных почв Красноярского края и на этапе предварительных исследований проявивших антибиотическую активность в отношении грибов (табл. 1).
Таблица 1
Штаммы-антагонисты, использованные в работе
|
Штамм |
Таксономическая принадлежность |
Метод идентификации |
|
RSA1 |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК |
|
RSA8 |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA13 |
Streptomyces hygroscopicus |
По нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК |
|
RSA16(1) |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA16(2) |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
CХ5 |
Bacillus cereus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
АЛ3 |
Bacillus cereus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
Ра1 |
Bacillus sp. |
Культурально-морфологический |
|
Ра2 |
Bacillus sp. |
Культурально-морфологический |
|
Ра3 |
Bacillus sp. |
Культурально-морфологический |
В качестве тест-культур использованы 9 различающихся по культурально-морфологическим признакам представителей р. Fusarium (штаммы Р1, Р2, Р4, Р6, Р12, Р13, Р22(1), Р22(2), P32), 2 представителя р. Alternaria (штамм Р31 – Alternaria sp., Р33 – A. japonica) и 2 представителя вида Sclerotinia sclerotiorum (штаммы P17 и P23). Все тест-культуры выделены авторами из семян и пораженных грибными болезнями растений ярового рапса, возделываемого в Красноярском крае, и идентифицированы по культурально-морфологическим признакам.
Оценку антибиотической активности штаммов-антагонистов в отношении тест-культур проводили методом встречных культур по ширине зоны подавления роста в трехкратной повторности после 10 суток инкубирования при температуре 25 ± 1 °C. В качестве питательной среды использовали среду № 2 ГРМ (Сабуро) производства ФБУН ГНЦ ПМБ, разведенную в 2 раза и дополненную агаром до 20 г/л. Ранее нами было показано, что подобная среда хорошо поддерживает рост как бактериальных штаммов-антагонистов р.р. Bacillus и Streptomyces, так и фитопатогенных грибов [3].
Для анализа сходства реакции тест-культур на набор штаммов-антагонистов использовали корреляционный анализ с последующим факторным анализом матрицы корреляций. При выделении значимых факторов использовали критерий Кайзера [4], который является одним из самых популярных, если не самым популярным, в современной научной литературе [5]. Согласно этому критерию считаются значимыми и принимаются к рассмотрению факторы с собственным значением больше 1. Для сравнения тест-культур по чувствительности к штаммам-антагонистам использовали двухфакторный дисперсионный анализ, где в качестве факторов выступали штамм антагониста и штамм тест-культуры. Для изучения влияния таксономической принадлежности тест-культур на их чувствительность к штаммам-антагонистам использовали однофакторный дисперсионный анализ, где в качестве фактора выступала родовая принадлежность тест-культуры, с последующим попарным сравнением чувствительности родов с помощью рекомендуемых в современной литературе post-hoc тестов Тьюки (Tukey HSD test) и Шеффе (Scheffe’s S test) [6]. Для сравнения штаммов тест-культур по чувствительности к набору штаммов-антагонистов, а также для сравнения штаммов-антагонистов по спектру активности в отношении тест-культур использовали дискриминантный анализ.
Результаты и их обсуждение. В зависимости от штамма-антагониста и тест-культуры средние по повторностям зоны подавления роста фитопатогенных грибов варьировали от 0 до 28 мм. Следует отметить, что даже при отсутствии выраженной зоны подавления роста, при контакте со штаммами-антагонистами рост тест-культур прекращался. Таким образом, даже в случаях, если ширина зоны подавления была 0 мм, говорить об отсутствии антагонизма нельзя (рис. 1).
Рис. 1. Примеры зон подавления роста возбудителей грибных болезней рапса штаммами-антагонистами: 1 – контроль без антагонистов; 2 – штамм-антагонист Pa3;
3 – штамм-антагонист RSA1; 4 – штамм-антагонист RSA13; 1, 2, 3 – тест-культура P6 (Fusarium sp.), 4 – тест-культура P2 (Fusarium sp.)
Двухфакторный дисперсионный анализ подтвердил, что антагонистический эффект статистически значимо (p < 0,001) зависит как от штамма-антагониста, так и от индивидуальных особенностей штамма фитопатогенного гриба, используемого в качестве тест-культуры. Кроме этого, выявился статистически значимый (p < 0,001) эффект взаимодействия факторов «Штамм-антагонист × Штамм фитопатогена». При этом основными источниками варьирования размеров зоны подавления являются особенности штамма фитопатогенного грибы (соответствующий показатель силы влияния составляет 48,08 %). Показатель силы влияния фактора «Штамм-антагонист» составил 18,35 %, показатель силы влияния взаимодействия «Штамм-антагонист × Штамм фитопатогена» составил 27,66 % (табл. 2).
Таблица 2
Результаты дисперсионного анализа влияния штамма-антагониста
и штамма фитопатогенного гриба на размер зоны подавления роста
|
Источник вариации |
Показатель силы влияния, % |
Статистическая значимость эффекта, p |
|
Штамм-антагонист |
18,35 |
0,000000 |
|
Штамм фитопатогена |
48,08 |
0,000000 |
|
Штамм-антагонист × Штамм фитопатогена |
27,66 |
0,000000 |
|
Случайное варьирование |
5,90 |
Эффект взаимодействия факторов «Штамм-антагонист × Штамм фитопатогена» проявился в том, что спектр антагонистической активности у разных штаммов-антагонистов различался. Так, например, штамм-антагонист СХ5 проявил высокую активность в отношении фитопатогенного штамма Р1 (зона подавления роста 8,0 мм), однако не показал существенного эффекта в отношении фитопатогенного штамма Р17 (зона подавления роста 0,0 мм). В противоположность этому штамм-антагонист АЛ3 проявил высокую активность в отношении фитопатогенного штамма Р17 (зона подавления роста 8,0 мм), однако показал существенно более слабый эффект в отношении фитопатогенного штамма Р1 (зона подавления роста 5,3 мм) (табл. 3).
Таблица 3
Средние зоны подавления роста у различных штаммов фитопатогенных грибов
в присутствии разных штаммов-антагонистов, мм
|
Штамм |
RSA1 |
RSA8 |
RSA13 |
RSA16 (1) |
RSA16 (2) |
CХ5 |
АЛ3 |
Ра1 |
Ра2 |
Ра3 |
|
Р1 |
6,0 |
5,7 |
24,0 |
4,3 |
5,0 |
8,0 |
5,3 |
4,3 |
2,3 |
4,3 |
|
Р2 |
4,7 |
4,3 |
25,0 |
4,0 |
5,7 |
3,0 |
3,7 |
3,3 |
0,0 |
0,0 |
|
Р4 |
3,7 |
3,7 |
0,0 |
5,0 |
3,7 |
6,0 |
2,7 |
4,7 |
0,0 |
0,0 |
|
Р6 |
4,3 |
4,3 |
8,7 |
3,7 |
4,0 |
3,0 |
3,0 |
4,0 |
0,0 |
0,0 |
|
Р12 |
4,3 |
3,0 |
5,7 |
1,7 |
2,3 |
3,0 |
2,7 |
5,3 |
0,0 |
0,0 |
|
Р13 |
4,3 |
2,7 |
16,0 |
3,7 |
4,0 |
3,7 |
3,0 |
5,7 |
0,0 |
0,0 |
|
Р17 |
5,7 |
5,7 |
17,7 |
5,0 |
2,0 |
0,0 |
8,7 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
|
Р22(1) |
3,0 |
1,7 |
10,0 |
6,7 |
3,0 |
5,3 |
3,3 |
4,0 |
0,0 |
0,0 |
|
Р22(2) |
4,0 |
4,3 |
5,7 |
5,0 |
2,3 |
5,7 |
4,0 |
6,0 |
0,0 |
0,0 |
|
Р23 |
6,7 |
5,3 |
2,7 |
4,0 |
2,0 |
0,0 |
8,0 |
0,0 |
0,0 |
1,7 |
|
Р32 |
13,7 |
12,3 |
25,0 |
12,0 |
25,0 |
14,7 |
11,3 |
17,0 |
0,0 |
5,0 |
|
Р31 |
11,3 |
25,0 |
19,3 |
12,3 |
24,3 |
8,3 |
28,0 |
8,0 |
22,0 |
25,0 |
|
Р33 |
16,0 |
13,0 |
31,0 |
12,3 |
17,7 |
6,7 |
20,0 |
6,3 |
9,0 |
13,3 |
Наблюдаемые различия в спектрах антифунгальной активности изучаемых штаммов свидетельствуют о том, что антифунгальный эффект штаммов-антагонистов обусловлен не одним антибиотическим веществом, а набором веществ, обладающих разным спектром антигрибной активности. При этом, судя по различиям в спектрах антифунгальной активности штаммов-антагонистов и различиям в размерах зон подавления роста (см. табл. 3), состав упомянутого набора, равно как и интенсивность продукции разных компонентов этого набора, у разных штаммов различается.
В целом по вариантам штаммов-антагонистов и тест-культур наиболее чувствительными к действию антагонистов оказались представители р. Alternaria. Согласно всем post-hoc тестам, средняя по повторностям и штаммам-антагонистам зона подавления роста у Alternaria spp. (16,45 ± 1,51 мм) была статистически значимо (p < 0,001) больше, чем у Fusarium spp. (5,20 ± 0,71 мм) и у S. sclerotiorum (3,75 ± 1,51 мм), в то время как между Fusarium spp. и S. sclerotiorum статистически значимые различия по этому показателю отсутствовали.
Дискриминантный анализ подтвердил, что штаммы-антагонисты статистически значимо (p < 0,001) различаются по спектру антигрибной активности, а фитопатогены, в свою очередь, статистически значимо (p < 0,001) различаются по спектру чувствительности к штаммам-антагонистам. При этом наблюдается статистически значимая (p < 0,001) группировка штаммов фитопатогенов по спектру чувствительности к штаммам-антагонистам в соответствии с таксономической принадлежностью фитопатогенов (табл. 4, рис. 2).
Таблица 4
Статистическая значимость (p) различий между тест-культурами разной таксономической принадлежности по спектру чувствительности к штаммам-антагонистам
по результатам дискриминантного анализа
|
Fusarium spp. |
Sclerotinia sclerotiorum |
Alternaria spp. |
|
|
Fusarium spp. |
0,000001 |
0,000000 |
|
|
Sclerotinia sclerotiorum |
0,000001 |
0,000000 |
|
|
Alternaria spp. |
0,000000 |
0,000000 |
Рис. 2. Проекция штаммов фитопатогенов в соответствии с их таксономической
принадлежностью на первые две канонические переменные по спектру чувствительности к штаммам-антагонистам; каждая точка соответствует отдельному измерению
для отдельного штамма фитопатогена
Столь ярко выраженные различия как между штаммами фитопатогенных грибов по спектру чувствительности к штаммам-антагонистам, так и между штаммами-антагонистами по спектру антибиотической активности в отношении фитопатогенных грибов, ставят вопрос о выборе конкретных штаммов фитопатогенов в качестве тест-культур для дальнейшего выявления и оценки штаммов-антагонистов. Для ответа на этот вопрос нами был использован факторный анализ матрицы корреляций чувствительности штаммов фитопатогенных грибов к набору штаммов-антагонистов, в качестве исходных данных для корреляционного анализа использованы данные таблицы 3. Поскольку включение в обработку штамма RSA13 порождало «ложные корреляции» (рис. 3), он был исключен из анализа.
Результирующая матрица корреляций представлена в таблице 5, в таблице 6 представлены результаты факторного анализа этой матрицы.
Рис. 3. Пример ложной корреляции: высокий (r = 0,968) коэффициент корреляции между реакцией двух штаммов фитопатогенных грибов на набор штаммов-антагонистов вызван тем,
что оба фитопатогенных гриба высокочувствительны к действию штамма-антагониста RSA13; исключение данного штамма из обработки приводит к резкому падению коэффициента корреляции до r = 0,488 корреляции
Таблица 5
Коэффициенты корреляции между зонами отсутствия роста у разных штаммов
фитопатогенных грибов после исключения из обработки штамма RSA13
|
Р1 |
Р2 |
Р4 |
Р6 |
Р12 |
Р13 |
Р17 |
Р22 (1) |
Р22 (2) |
Р23 |
Р32 |
|
|
Р2 |
0,49 |
1,00 |
0,72 |
0,95 |
0,66 |
0,80 |
0,54 |
0,58 |
0,64 |
0,47 |
0,86 |
|
Р4 |
0,68 |
0,72 |
1,00 |
0,82 |
0,71 |
0,86 |
0,16 |
0,89 |
0,93 |
0,05 |
0,71 |
|
Р6 |
0,52 |
0,95 |
0,82 |
1,00 |
0,82 |
0,89 |
0,49 |
0,64 |
0,81 |
0,42 |
0,80 |
|
Р12 |
0,49 |
0,66 |
0,71 |
0,82 |
1,00 |
0,91 |
0,23 |
0,48 |
0,82 |
0,21 |
0,64 |
|
Р13 |
0,46 |
0,80 |
0,86 |
0,89 |
0,91 |
1,00 |
0,22 |
0,74 |
0,86 |
0,15 |
0,82 |
|
Р17 |
0,20 |
0,54 |
0,16 |
0,49 |
0,23 |
0,22 |
1,00 |
0,23 |
0,30 |
0,97 |
0,12 |
|
Р22(1) |
0,48 |
0,58 |
0,89 |
0,64 |
0,48 |
0,74 |
0,23 |
1,00 |
0,83 |
0,10 |
0,54 |
|
Р22(2) |
0,61 |
0,64 |
0,93 |
0,81 |
0,82 |
0,86 |
0,30 |
0,83 |
1,00 |
0,18 |
0,56 |
|
Р23 |
0,21 |
0,47 |
0,05 |
0,42 |
0,21 |
0,15 |
0,97 |
0,10 |
0,18 |
1,00 |
0,07 |
|
Р32 |
0,49 |
0,86 |
0,71 |
0,80 |
0,64 |
0,82 |
0,12 |
0,54 |
0,56 |
0,07 |
1,00 |
|
Р31 |
–0,33 |
–0,16 |
–0,66 |
–0,36 |
–0,56 |
–0,61 |
0,31 |
–0,64 |
–0,64 |
0,34 |
–0,23 |
|
Р33 |
0,03 |
0,41 |
–0,21 |
0,19 |
–0,10 |
–0,04 |
0,73 |
–0,12 |
–0,22 |
0,79 |
0,21 |
Примечание: жирным шрифтом выделены коэффициенты корреляции, статистически значимые на уровне p < 0,05.
Обращает на себя внимание тот факт, что статистически значимые корреляции по чувствительности к набору штаммов-антагонистов наблюдаются далеко не у всех тест-культур фитопатогенных грибов. Так, например, штаммы P17 и P23 (оба – представители вида S. sclerotiorum) демонстрируют очень высокое сходство реакции на набор изучаемых штаммов (коэффициент корреляции r = 0,97), однако статистически значимые корреляции со штаммами, представляющими р. Fusarium, по реакции на штаммы-антагонисты у них отсутствуют. Реакция штамма Р13 (р. Fusarium) на набор штаммов-антагонистов хорошо коррелирует с реакцией других штаммов того же рода (коэффициенты корреляции от 0,74 до 0,91), однако не коррелирует с реакцией представителей р. Sclerotinia и Alternaria. Все это подтверждает наличие у исследуемых антагонистов набора антифунгальных соединений, специфически нацеленных против разных таксономических групп грибов. Этот же вывод подтверждается факторным анализом корреляционной матрицы (табл. 6).
Таблица 6
Факторные нагрузки по результатам факторного анализа корреляционной матрицы,
представленной в таблице 5
|
Штамм фитопатогена |
Без вращения |
Варимаксное вращение |
||
|
Factor 1 |
Factor 2 |
Factor 1 |
Factor 2 |
|
|
Р1 (Fus) |
–0,653 |
–0,009 |
0,646 |
0,095 |
|
Р2 (Fus) |
–0,869 |
0,362 |
0,800 |
0,496 |
|
Р4 (Fus) |
–0,936 |
–0,250 |
0,964 |
–0,097 |
|
Р6(Fus) |
–0,944 |
0,193 |
0,901 |
0,342 |
|
Р12 (Fus) |
–0,852 |
–0,096 |
0,856 |
0,041 |
|
Р13 (Fus) |
–0,949 |
–0,116 |
0,955 |
0,037 |
|
Р17 (Scl) |
–0,372 |
0,844 |
0,232 |
0,892 |
|
Р22(1) (Fus) |
–0,806 |
–0,198 |
0,827 |
–0,067 |
|
Р22(2) (Fus) |
–0,918 |
–0,186 |
0,935 |
–0,037 |
|
Р23 (Scl) |
–0,292 |
0,883 |
0,147 |
0,918 |
|
Р32 (Fus) |
–0,796 |
0,056 |
0,777 |
0,182 |
|
Р31 (Alt) |
0,548 |
0,708 |
–0,654 |
0,611 |
|
Р33(Alt) |
–0,040 |
0,947 |
–0,112 |
0,941 |
|
Собственное значение |
7,226 |
3,219 |
7,123 |
3,322 |
|
% вариации |
55,6 |
24,8 |
54,8 |
25,6 |
Примечание: факторные нагрузки больше 0,70 выделены жирным шрифтом.
Как видно из представленных данных, после исключения из обработки штамма RSA13 варьирование изученных штаммов фитопатогенных грибов по чувствительности к штаммам-антагонистам на 80,3 % объясняется действием двух факторов с собственными значениями выше 1. При этом на основе факторных нагрузок (см. табл. 6) первый фактор можно интерпретировать как антибиотические вещества, эффективные против Fusarium spp., а второй – как антибиотические вещества, эффективные против S. sclerotiorum и Alternaria spp.
Распределение штаммов по величине первого и второго факторов представлено на рисунке 4.
Как видно из представленных на рисунке 4 данных, ни один из протестированных штаммов-антагонистов не является максимально эффективным одновременно по Factor 1 и Factor 2. Это говорит о том, что ни один из изученных штаммов-антагонистов не продуцирует в достаточном количестве весь спектр антибиотических веществ, эффективных против всего набора тест-культур фитопатогенных грибов.
Однако использование этих штаммов в комбинациях позволяет преодолеть данный недостаток. Так, на основе рисунка 4 можно предложить комбинацию штаммов СХ5+Pa1 (у обоих – максимальная эффективность по Factor 1) и АЛ3 (максимальная эффективность по Factor 2).
Рис. 4. Проекция штаммов на первые два главных фактора
(использовано варимаксное вращение, см. табл. 6)
Использование результатов факторного анализа позволило сократить число тест-культур, используемых для тестирования штаммов-антагонистов, выделяемых в дальнейшем. Так, для оценки штаммов-антагонистов по величине первого антигрибного фактора достаточно использовать одну тест-культуру с высокой по абсолютному значению факторной нагрузкой (что эквивалентно высокой чувствительности) по Factor 1, а для оценки штаммов-антагонистов по величине второго антигрибного фактора достаточно использовать одну тест-культуру с высокой по абсолютному значению факторной нагрузкой по Factor 2.
Заключение
- При массовом скрининге штаммов-антагонистов против набора таксономически и биологически различающихся штаммов фитопатогенных грибов использование методов многомерной статистики позволяет резко сократить
объем работы, выбрав на основе предварительных исследований в качестве тест-культур наиболее типичные штаммы фитопатогенов.
В случае разнообразия видового состава возбудителей грибных болезней культуры, для защиты которой предполагается разработка биопрепарата, целесообразно создавать комплексный препарат на основе набора штаммов-антагонистов, имеющих разный спектр антигрибной активности.
1. Microbial interactions within multiple-strain biological control agents impact soil-borne plant disease / B. Niu [et al.] // Frontiers in Microbiology. 2020. Vol. 11. P. 585404.
2. Microbial Consortia for Plant Protection against Diseases: More than the Sum of Its Parts / T. Maciag [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. 2023. Vol. 24, №. 15. P. 12227.
3. Почвенные микробные сообщества как источник штаммов для биологической защиты сои от фузариоза в Приенисейской Сибири / С.А. Родовиков [и др.] // Вестник Нижневартовского государственного университета. 2020. № 2. С. 4–11. DOI:https://doi.org/10.36906/2311-4444/ 20-2/01.
4. Kaiser H.F. The Application of Electronic Computers to Factor Analysis // Educational and Psychological Measurement. 1960. 20 (1). P. 141–151.
5. Hayton J.C., Allen D.G., Scaprello V. Factor Retention Decisions in Exploratory Factor Analysis: A Tutorial on Parallel Analysis // Organizational Research Methods. 2004. Vol. 7. № 2. P. 191–205.
6. Comparing multiple comparisons: practical guidance for choosing the best multiple comparisons test / S. Midway [и др.] // Bioinformatics and Genomics. 2020. DOI:https://doi.org/10.7717/peerj. 10387.
