Республика Крым, Россия
Республика Крым, Россия
Республика Крым, Россия
УДК 612.115 Свертывание крови
Цель исследования – изучить динамику показателей системы гемостаза у кроликов после прижизненного экспериментального моделирования забрюшинной гематомы. Объект исследования – 50 самцов кроликов породы Серый Великан, из которых сформированы опытная и контрольная группы по 25 особей каждая. Животным опытной группы под неингаляционным наркозом проводили прижизненное моделирование забрюшинной гематомы по разработанному нами способу, включающему отбор крови из ушной артерии с добавлением антикоагулянта и с последующим введением аутокрови в забрюшинное пространство. Животные контрольной группы подвергались только неингаляционному наркозу. Прижизненное экспериментальное моделирование забрюшинной гематомы у кроликов приводило к ряду значимых изменений в системе гемостаза, которые были наиболее выражены в первые 14 сут после проведения эксперимента. Международное нормализованное отношение (МНО) в опытной группе животных имело достоверно низкие значения по сравнению с контрольной только на 1-е, 3-и и 7-е сут, а активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) – на 1-е, 3-и, 7-е и 14-е сут после проведения эксперимента. В уровне фибриногена плазмы крови между животными опытной и контрольной групп достоверных отличий выявлено не было. Тромбиновое время (ТВ) у животных опытной группы достоверно выше только на 1-е, 3-и, 7-е и 14-е сут, а содержание D-димера оказалось достоверно больше во всех исследуемых сроках после проведения эксперимента в сравнении с контрольной группой животных. Наивысший уровень D-димера в плазме крови животных опытной группы регистрировался на 7-е сут и, вероятно, свидетельствовал о том, что при забрюшинных гематомах в это время происходят самые активные процессы фибринолиза. Низкие значения МНО в первые 7 сут и АЧТВ в первые 14 сут, а также удлинение ТВ в первые 14 сут после проведения эксперимента дают основания полагать, что при забрюшинных гематомах в эти сроки повышается порог вероятности тромбообразования.
система гемостаза, забрюшинная гематома, экспериментальное моделирование, кролики
Введение. Гемостаз охватывает строго регулируемые процессы свертывания крови, активации тромбоцитов и восстановления сосудов. После травмы система гемостаза задействует множество сосудистых и внесосудистых рецепторов, которые действуют совместно с компонентами крови, устраняя повреждения, нанесенные сосудистой сети и окружающим тканям [1].
Последствия нарушений системы гемостаза, как врожденных, так и приобретенных, часто представляют значительную проблему в диагностике и терапии. Логичное и эффективное лечение зависит: от правильной идентификации задействованных гемостатических компонентов; понимания сложных, тонко модулируемых взаимодействий различных систем ферментов / ингибиторов; знания механизма, с помощью которого различные, по-видимому, не связанные между собой патологические процессы могут ускорять нежелательные явления, такие как тромбоз, эмболия или кровотечение [2].
Фибрин играет важную роль в гемостазе как первичный продукт каскада свертывания и конечный субстрат для фибринолиза. На активность фибринолиза в значительной степени влияет структура сгустка, изоформы и полиморфизмы фибриногена, скорость образования тромбина, реактивность связанных с тромбом клеток (тромбоциты) и общая биохимическая среда. Регулирование фибринолитической системы, как и каскада свертывания, осуществляется широким спектром кофакторов, рецепторов и ингибиторов. Фибринолитическая активность может генерироваться либо на поверхности фибринсодержащего тромба, либо на клетках, которые экспрессируют профибринолитические рецепторы [3].
Забрюшинные гематомы у животных могут иметь разное происхождение и характер [4–7], при этом специфика их образования и действие на гомеостаз организма остаются малоизученными, а сведения об оценке динамики показателей системы гемостаза при данной патологии в доступной литературе отсутствуют.
Цель исследования – изучить динамику показателей системы гемостаза у кроликов после прижизненного экспериментального моделирования забрюшинной гематомы.
Объекты и методы. Объектом исследования служили 50 самцов кроликов породы Серый Великан, из которых сформированы опытная (25 особей) и контрольная (25 особей) группы.
Животным опытной группы под неингаляционным наркозом проводили прижизненное моделирование забрюшинной гематомы по разработанному нами способу [8], включающему отбор крови из ушной артерии с добавлением антикоагулянта и с последующим введением аутокрови в забрюшинное пространство. Для этого животное фиксируют на операционном столе в боковом положении с подготовкой операционного поля в правой или левой поясничной области, после чего, отступив 2 см от поперечно-реберного отростка 3-го поясничного позвонка, проводят разрез кожи длиной до 1 см с последующим введением вращательно-поступательными движениями в операционную рану через внутреннюю косую брюшную мышцу под углом 45 градусов по отношению к остистым отросткам по направлению к брюшной полости канюли из хирургической стали с боковым отверстием размером G16 70 мм на глубину 3–4 см. Убедившись в правильности положения канюли по рентгенографии, вводят предварительно отобранную из ушной артерии аутокровь. Объем введенной аутокрови в забрюшинное пространство составлял 1,0 % от массы тела кролика.
Животные контрольной группы подвергались только неингаляционному наркозу.
Отбор проб крови у животных опытной и контрольной группы проводили натощак посредством венепункции подкожной вены предплечья в вакуумные пробирки фирмы «МиниМед» (Россия) с цитратом натрия (1 : 9) 3,8 % через 1, 3, 7, 14 и 28 сут после проведения эксперимента. После забора крови животных выводили из эксперимента.
Определение протромбинового времени (ПТВ) с получением международного нормализованного отношения (МНО), а также активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), тромбинового времени (ТВ) и уровня фибриногена проводили на автоматическом анализаторе коагуляции крови серии СА-600 производства Sysmex (Япония) с помощью
реактивов фирмы Siemens (Германия).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим множественным сравнением Ньюмена-Кейлса в программе Primer of Biostatistics 4.03. Достоверными считали различия при р < 0,05.
Результаты и их обсуждение. Показатели системы гемостаза кроликов после прижизненного экспериментального моделирования забрюшинной гематомы представлены в таблице.
Протромбиновое время является одним из наиболее важных лабораторных тестов для определения функциональности системы свертывания крови. Он используется для диагностики заболеваний свертывающей системы крови, оценки риска кровотечения у пациентов, перенесших оперативные вмешательства, наблюдения за пациентами, получающими терапию пероральными антикоагулянтами, и оценки функции печени [9]. Международное нормализованное отношение (МНО) – это стандартизированный показатель протромбинового теста, который рассчитывается на основании протромбинового времени пациента, протромбинового времени нормы и международного индекса чувствительности [10]. При изучении МНО у кроликов после прижизненного экспериментального моделирования забрюшинной гематомы установлено, что на 1-е, 3-и и 7-е сут после проведения эксперимента этот показатель в опытной группе имеет на 15,55 %, 7,53 и 5,76 % соответственно достоверно более низкие значения по сравнению с контрольной группой. На 14-е и 28-е сут после проведения эксперимента достоверных различий МНО между опытной и контрольной группой уже не определяется. При сравнении МНО между сроками исследования после проведения эксперимента в опытной группе достоверных различий не выявлено, при этом значение данного показателя имеет тенденцию к повышению (табл.).
Показатели системы гемостаза кроликов
после экспериментального моделирования забрюшинной гематомы
|
Группа (n = 5) |
Срок исследования после проведения эксперимента, сут |
||||
|
1 |
3 |
7 |
14 |
28 |
|
|
M±m |
|||||
|
МНО, у. е. |
|||||
|
Контрольная |
0,550±0,014 |
0,514±0,008 |
0,514±0,005 |
0,530±0,009 |
0,524±0,007 |
|
Опытная |
0,476±0,004* |
0,478±0,004* |
0,486±0,007* |
0,504±0,005 |
0,524±0,005 |
|
АЧТВ, с |
|||||
|
Контрольная |
139,20±3,60 |
124,60±4,19 |
129,80±2,54 |
129,40±1,36 |
129,00±2,30 |
|
Опытная |
91,20±1,46* |
101,40±1,21*# |
103,00±1,52* |
109,40±1,63* |
123,40±2,23# |
|
Фибриноген, г/л |
|||||
|
Контрольная |
3,080±0,045 |
3,420±0,234 |
3,386±0,097 |
2,652±0,137 |
3,076±0,179 |
|
Опытная |
2,890±0,083 |
3,540±0,099# |
3,716±0,034 |
2,710±0,097# |
2,882±0,046 |
|
ТВ, с |
|||||
|
Контрольная |
16,90±0,10 |
17,52±0,25 |
19,64±0,58 |
19,06±0,29 |
17,38±0,19 |
|
Опытная |
23,40±0,66* |
21,70±0,69*# |
26,76±0,87*# |
21,10±0,27*# |
19,08±0,21# |
|
D-димер, нг/мл |
|||||
|
Контрольная |
41,0±1,9 |
43,6±1,5 |
53,0±1,6 |
71,8±2,8 |
41,2±7,0 |
|
Опытная |
90,2±2,1* |
167,2±3,9*# |
250,2±4,9*# |
140,4±4,1*# |
122,6±7,5*# |
Примечание: (*) – статистическая значимость различий (при р < 0,05) в идентичных сроках исследования у опытной группы по сравнению с контрольной; (#) – у каждого последующего срока исследования опытной группы по сравнению с предыдущим.
Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) может отражать дефицит следующих факторов: высокомолекулярный кининоген; прекалликреин; XII, XI, IX, VIII, X и V факторы; протромбин и фибриноген [11]. Анализируя АЧТВ у кроликов после прижизненного экспериментального моделирования забрюшинной гематомы выяснено, что значение данного показателя у опытной группы достоверно выше только на 1-е, 3-и, 7-е и 14-е сут после проведения эксперимента на 52,63; 22,88; 26,02 и 18,28 % соответственно по сравнению с контрольной группой. В опытной группе АЧТВ у экспериментальных животных достоверно удлиняется только с 1-х до 3-х сут (на 11,18 %) и с 14-х до 28-х сут (на 12,80 %).
Фибриноген и фактор XIII являются двумя важнейшими белками, которые непосредственно участвуют в образовании фибринового геля в качестве заключительного этапа последовательности реакций, запускаемых прокоагулянтным стимулом, а также, в дополнение к их гемостатической функции, влияют на врожденный иммунитет, клеточно-опосредованные реакции, такие как заживление ран, реакция на повреждение ткани или воспалительные процессы [12]. Содержание фибриногена в плазме крови кроликов после прижизненного моделирования экспериментальной забрюшинной гематомы достоверно не изменяется по сравнению с контрольной группой. Однако в опытной группе значение этого показателя, имея волнообразную динамику, достоверно увеличивается с 1-х до 3-х сут после проведения эксперимента на 22,49 %, а с 7-х до 14-х сут – достоверно уменьшается на 37,12 %.
Тромбиновое время (ТВ) – это анализ свертываемости крови, который отражает превращение фибриногена в фибрин после добавления тромбинового реагента. Измерение свертываемости фибриногена и ТВ позволяет выявлять врожденные и приобретенные качественные и количественные нарушения фибриногена, которые могут привести к тромботическим явлениям или кровотечениям [13]. При оценке ТВ у кроликов после прижизненного экспериментального моделирования забрюшинной гематомы установлено, что значение данного показателя в опытной группе достоверно больше на
1-е, 3-и, 7-е и 14-е сут после проведения эксперимента – на 38,46; 23,86; 36,25 и 10,70 % соответственно по сравнению с контрольной группой. В опытной группе динамика изменения ТВ имеет волнообразный характер и с 1-х до 3-х сут после эксперимента достоверно уменьшается на 7,83 %; с 3-х до 7-х сут – достоверно возрастает на 23,32; с 7-х до 14-х сут – достоверно уменьшается на 26,82 и с 14-х до 28-х сут – вновь достоверно уменьшается на 10,59 %.
Низкие значения МНО в первые 7 сут и АЧТВ в первые 14 сут, а также удлинение ТВ в первые 14 сут после проведения эксперимента дают основания полагать, что при забрюшинных гематомах в эти сроки повышается порог вероятности тромбообразования.
D-димер представляет собой растворимый продукт разложения фибрина, который образуется в результате упорядоченного расщепления тромбов фибринолитической системой. Многочисленные исследования показали, что D-димер служит ценным маркером активации свертывания и фибринолиза [14]. При анализе уровня D-димера в плазме крови кроликов после прижизненного экспериментального моделирования забрюшинной гематомы выяснено, что значение данного показателя в опытной группе на 1-е сут после проведения эксперимента достоверно выше в 2,2 раза; на 3-е сут – в 3,84; на 7-е сут – в 4,72; на 14-е сут – в 1,96 и на 28-е сут – в 2,98 раза, чем в контрольной группе. В опытной группе животных уровень D-димера в плазме крови достоверно увеличивается с 1-х до 3-х сут на 85,37 % и с 3-х до 7-х сут – на 49,64 %, а затем достоверно уменьшается с 7-х до 14-х сут на 78,21 % и с 14-х до 28-х сут на 14,52 %. Наивысший уровень D-димера в плазме крови животных опытной группы регистрируется на 7-е сут и, вероятно, свидетельствует, что при забрюшинных гематомах в это время происходят самые активные процессы фибринолиза.
Заключение. Прижизненное экспериментальное моделирование забрюшинной гематомы у кроликов приводит к ряду значимых изменений в системе гемостаза, которые наиболее выражены в первые 14 сут после проведения эксперимента. МНО в опытной группе животных имеет достоверно низкие значения по сравнению с контрольной только на 1-е, 3-и и 7-е сут, а АЧТВ – на 1-е, 3-и, 7-е и 14-е сут после проведения эксперимента. В уровне фибриногена плазмы крови между животными опытной и контрольной группы достоверных отличий выявлено не было. ТВ у животных опытной группы достоверно выше только на 1-е, 3-и, 7-е и 14-е сут, а содержание D-димера оказалось достоверно больше во всех исследуемых сроках после проведения эксперимента в сравнении с контрольной группой животных.
1. New fundamentals in hemostasis / H.H. Versteeg [et al.] // Physiol Rev. 2013. Vol. 93, № 1. P. 327–358.
2. Bick R.L., Murano G. Physiology of hemostasis // Clin Lab Med. 1994. Vol. 14, № 4. P. 677–707.
3. Chapin J.C., Hajjar K.A. Fibrinolysis and the control of blood // Blood Rev. 2015. Vol. 29, № 1. P. 17–24.
4. Diekstall M., Rijkenhuizen A. Mesorectal hematoma associated with colic and caudal neurological signs in a horse // Pferdeheilkunde. 2018. Vol. 34, № 3. P. 232–236.
5. Renal cell carcinoma in a stallion with hematuria and hemoperitoneum / M. Franz [at al.] // Tierarztliche Praxis. Ausgabe G: Grosstiere – Nutztiere. 2006. Vol. 34, № 6. P. 397–398; 405–409.
6. Hepatosplenic T-cell lymphoma in a mare / P. Roccabianca [at al.] // Veterinary pathology. 2002. Vol. 39, № 4. P. 508–511.
7. Saetra T., Breuhaus B., Hildebran A. Unilateral nephrolithiasis with renal rupture in a horse // Veterinary Education. 2018. Vol. 30, № 12. P. 635–639.
8. Пат. № 2793527(13) C1 Российская Федерация МПК G09B 23/28 (2006.01) A61B 17/00 (2006.01) A61B 17/34 (2006.01). Способ прижизненного моделирования забрюшинной гематомы у кроликов / Данников С.П., Антонова И.Э., Скрипкин В.С., Квочко А.Н., Дилекова О.В.; заявитель Ставропольский гос. аграр. ун-т. № 2022121425; заявл. 05.08.2022; опубл. 04.04.2023, Бюл. № 10. 10 с.
9. Riley R.S., Rowe D., Fisher L.M. Clinical utilization of the international normalized ratio (INR) // J Clin Lab Anal. 2000. Vol. 14, № 3. P. 101–114.
10. Improving harmonisation International Norma-lized Ratio (INR): time to think outside the box? / E.J. Favaloro [et al.] // Clin Chem Lab Med. 2010. Vol. 48, № 8. P. 1079–1090.
11. Ignjatovic V. Activated partialthromboplastin time // Methods Mol Biol. 2013. Vol. 992. P. 111–120.
12. Hoppe B. Fibrinogen and factor XIII at the intersection of coagulation, fibrinolysis and inflammation // Thromb Haemost. 2014. Vol. 112, № 4. Р. 649–658.
13. Ignjatovic V. Thrombin clotting time // Methods Mol Biol. 2013. Vol. 992. P. 131–138.
14. Weitz J.I., Fredenburgh J.C., Eikelboom J.W. A Test in Context: D-Dimer // J Am Coll Cardiol. 2017. Vol. 70, № 19. Р. 2411–2420.
