Постановка проблемы (Introduction)
Мясо является главным продуктом свиноводческой отрасли. С увеличением объемов производимой свинины растут ожидания потребителей в отношении ее качества. Визуальные характеристики, такие как цвет, количество жира и мраморность, являются объективными показателями качества мяса, которые тесно связаны с ожиданиями и требованиями потребителей и их конечным выбором при покупке. Также конкурентоспособность отечественной свинины может быть обеспечена только при достижении качества продукции в соответствии с требованиями рынка и повышением рентабельности ее производства. Таким образом, при интенсификации отрасли свиноводства должен учитываться потребительский спрос и в соответствии с этим корректироваться селекционные стратегии.
Изучение генетической детерминации качественных показателей мяса свиней различных пород и их сочетаний в совокупности с возможностью использования в перспективе полученных результатов позволит повысить эффективность производства высококачественной свинины за счет использования в качестве инструмента молекулярных подходов и оптимизации селекционно-племенной работы.
Содержание внутримышечного жира (ВМЖ, мраморность), расположенного в скелетных мышцах, является основной качественной характеристикой мяса, влияющей на органолептические свойства, такие как вкус и текстура [1, c. 157], сочность и аромат [2, c. 113]. Мясо с более высоким содержанием внутримышечного жира, как правило, имеет лучший вкус, сочность и нежность, что приводит к более высокой потребительской привлекательности. Следовательно, при разведении свиней с более высоким ВМЖ можно получить более вкусную свинину [3, c. 1–2 . Содержание внутримышечного жира и состав жирных кислот также влияют и на пищевую ценность свинины [4, c. 1]. Кроме того, надлежащие уровни ВМЖ предотвращают потерю влаги при тепловой обработке (гриле, жарении или варке) мяса. Селекция свиней на постность и мясность была очень эффективной в последние десятилетия, позволила значительно увеличить скорость роста свиней, снизив количество общего жира, вместе с которым уменьшилось содержание внутримышечного жира.
Помимо важности ВМЖ для органолептических качеств мяса, содержание жира и состав жирных кислот имеют имеет особое значение для питания и здоровья людей [5, с. 385; 6, с. 2]. Жир животного происхождения связывают с наличием больших количеств насыщенных жирных кислот (НЖК), которые, в свою очередь, повышают уровень холестерина в сыворотке крови и липопротеинов низкой плотности, тем самым увеличивая риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний. Количество ВМЖ детерминировано генетическими и средовыми факторами. Коэффициент наследуемости данного признака составляет 0,39–0,65 и зависит от таких показателей, как толщина шпика, пол, возраст, рацион [7, с. 3–4]. На количество внутримышечного жира оказывают влияние порода и даже линейная принадлежность внутри породы [8, с. 2].
Чтобы вести селекцию по мраморности, необходимо регулярно оценивать этот признак. Однако его измерение дорого, трудоемко и возможно после убоя животного, что может быть сделано только на ограниченном числе животных в племенных популяциях. В мире предлагаются различные решения по прогнозу мясных качеств при жизни животного. На данный момент насчитывается пять основных неинвазивных технологий оценки мясных качеств: ультразвук, визуальный анализ изображений с помощью мониторинга, двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия, магнитно-резонансная томография и компьютерная томография. Каждая из этих технологий характеризуется рядом плюсов и минусов, но следует отметить одну из них – ультразвук. Эта технология не требует приобретения дорогостоящего оборудования и характеризуется легкостью в использовании [9, c. 319]. Оценка содержания ВМЖ у живой свиньи с использованием ультразвука в реальном времени является осуществимой, достигаются умеренные корреляции между количеством ВМЖ, определенным химическим способом, и прогнозируемым ВМЖ, определенным с помощью ультразвука. Исследования группы ученых из Айовы, основанные на использовании ультразвукового сканирования и анализе изображений, показали, что данная технология пригодна для прогноза содержания внутримышечного жира в длиннейшей мышце спины живых свиней и используется в программе улучшения качества канадских свиней. Показано наличие корреляции между ультразвуковой оценкой мраморности и химической – 0,69; между ультразвуковой и визуальной оценкой – 0,55. По данным Jung J.-H. и коллег (2015) [9, c. 321], оценки генетических и фенотипических корреляций между ультразвуковой оценкой мраморности и химической составляли 0,75 и 0,76. Исследование геномных ассоциаций (GWAS) с содержанием внутримышечного жира у свиней различных породных сочетаний показал, что средний уровень ВМЖ у североамериканских пород свиней составляет около 1,5 %, идеальным считается содержание ВМЖ > 3 %.
В данном аспекте исследование генов, участвующих в метаболизме липидов, представляет научный и практический интерес. Chen и коллеги [10, c. 6767] показали, что полиморфизм в генах H-FABP и ACSL4 ассоциирован с ВМЖ у свиней различных пород. В наших исследованиях также подтверждено влияние генотипа по H-FABP и по PRKAG 3 на содержание внутримышечного жира [11, с. 11; 12, с. 69].
Стеароил-КоA-десатураза (SCD) – энзим эндоплазматического ретикулума, который катализирует биосинтез мононенасыщенных жирных кислот из насыщенных жирных кислот, которые либо синтезируются de novo, либо получены из рациона. SCD в сочетании с НАДН2-цитохром b5 редуктазой и электроноакцепторным цитохромом b5, а также молекулярным кислородом вводит одинарную двойную связь в спектре прерванных метиленом жирных ацил-КоА субстратов. Играет важную роль в биосинтезе липидов, в регулировании экспрессии генов, участвующих в липогенезе, и в регулировании окисления митохондриальных жирных кислот. Участвует в энергетическом гомеостазе организма. Способствует биосинтезу мембранных фосфолипидов, сложных эфиров холестерина и триглицеридов. Предполагается, что липогенный фермент стеароил-КоА-десатураза (SCD) играет ключевую роль в образовании ВМЖ у свиней. Ген стеароил-КоА-десатуразы (SCD) локализован на SSC 14 в области, где ранее были обнаружены локусы количественных признаков (QTL) состава жирных кислот и температуры плавления жира у свиней. Фермент стеароил-КоА-десатураза играет роль в биосинтезе ненасыщенных жирных кислот [13, с. 6]. Показана линейная зависимость между экспрессией белка SCD и общим содержанием жирных кислот в мышцах. Ген стеароил-КоА-десатуразы (SCD) играет решающую роль в превращении насыщенных ЖК в мононенасыщенные ЖК и, следовательно, входит в число генов-кандидатов, ответственных за содержание жира у свиней [14, с. 156]. Гаплотипы гена SCD оказывали сильное влияние на температуру плавления жирных кислот в популяции дюрок [15, с. 41]. На сегодняшний день известно порядка 18 мутаций в гене SCD, среди которых значимый эффект показан для аллеля T в позиции 2228, способствующего десатурации жира в мышцах и подкожной жировой клетчатке у свиней породы дюрок [3, с. 9]. Fernandes и соавторы [16, с. 102] обнаружили потенциальные эффекты генотипов по SCD на отложение внутримышечного жира, но не выявили их влияния на толщину шпика. А в работе Li и коллег [17, с. 6] уровень экспрессии SCD показал значительное различие между группами с высоким и низким содержанием внутримышечного жира, что позволяет предположить, что это важный кандидатный ген, влияющий на отложение ВМЖ.
Изучение аллелофонда свиней отечественной репродукции, определение популяционно-генетических параметров по ДНК-маркерам, поиск ассоциаций генетических вариантов с экономически-значимыми признаками характеризуется научной новизной и практической значимостью. Поскольку различными учеными показана роль фермента SCD в формировании признаков, связанных с содержанием и составом ВМЖ, то исследование полиморфизма гена SCD у свиней различных пород, разводимых на территории Российской Федерации, представляет интерес в аспекте его использования в качестве потенциального ДНК-маркера качественных признаков мяса.
Методология и методы исследований (Methods)
Цель исследований – изучение влияния полиморфизма g.2228 T > C в гене SCD (Accession No. Y 487830) на содержание внутримышечного жира и поиск ассоциаций генотипов с экономически значимыми признаками у свиней пород дюрок и крупная белая отечественной репродукции.
При выполнении исследований использовалось оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. академика Л. К. Эрнста.
Исследования проводили в 2019 году на свиньях пород крупная белая (КБ, n = 220), ландрас (Л, n = 161) и дюрок (Д, n = 142), разводимых в ООО «Селекционно-гибридный центр» (Воронежская область). От опытных животных отбирали пробы ткани (ушной выщип), которые непосредственно после отбора помещали в 1,5 мл пробирки с 96-процентным этиловым спиртом и помещали на хранение при –20° С в коллекцию ткани и ДНК УНУ «Банк генетического материала животных и птиц» ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л. К. Эрнста. Свиньи содержались в групповых станках с щелевыми полами группами по 15 голов. Животные имели неограниченный доступ к кормам и воде. Основной рацион и условия содержания животных были идентичны и соответствовали зоогигиеническим нормам.
Геномную ДНК выделяли с использованием набора реагентов ДНК Экстран-2 (ООО «НПФ Синтол», Россия) согласно рекомендациям производителя. Качество и концентрацию ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen / Life Technologies, США) и cпектрофотометра Nano Drop 8000 (Thermo Fisher Scientific, США). Генотипы по SCD (T → C в позиции 2228, генный банк NCBIY487830) определяли методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на ДНК-амплификаторе Quant Studio 5 (Thermo Fisher Scientific, США). Тест-система предусматривает амплификацию в режиме реального времени фрагмента длиной 114 п. о., содержащего область мутации, с использованием двух специфических праймеров SCD-RT-F (5’-AAGGCTAGAGCTGGCAGTGGGC-3’) и SCD-RT-R (5’-CACGGTGAGCCAACTCTGCGCA-3’) и двух аллель-специфичных зондов, окрашенных красителями SCD-FAM(FAM-ACCGTATCCTGTATTTCCT-BHQ-1) и SCD-R6G (R6G-ACCGTGTCCTGTATTTCCT-BHQ-1). Подбор праймеров осуществлялся при поддержке интернет-ресурса Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Синтез олигонуклеотидов выполнялся в ООО «Евроген» (Россия).
Частоты встречаемости генотипов рассчитывали по формуле (1):
pi = ni / N (1)
где ni – число животных с i-м генотипом,
N – объем выборки.
Частоты встречаемости аллелей рассчитывали по следующей формуле (2):
pi = (2×Nii + Niy) / (2×N), (2)
где pi – частота встречаемости i-го аллеля,
Nii – число животных, гомозиготных по i-му аллелю,
Niy – число животных, гетерозиготных по i-му аллелю (y – любой другой аллель), N – объем выборки.
При достижении среднего возраста животных 154 ± 0,7 дн. проводили оценку следующих признаков: оценивали живую массу (кг), осуществляли прижизненное определение содержания внутримышечного жира (%), толщины шпика (мм) и постности (%) с использованием УЗИ-сканера ExaGo (IMV Imaging, Франция) у 103 хряков породы дюрок, 27 свинок породы дюрок и 30 хряков породы крупная белая.
При оценке эффекта генотипа по SCD на репродуктивные качества использовали уравнение модели для многофакторного дисперсионного анализа с взаимодействием:
y = µ + B×S + G + B×S×G + е,
где y – учитываемые показатели;
µ – общее среднее по выборке из n животных;
B×S – эффект взаимодействия факторов породы и пола;
G – эффект генотипа по SCD;
B×S×G – эффект взаимодействия эффектов породы, пола и генотипа по SCD;
e – остаточный эффект, не включенный в данную модель.
Для оценки статистической значимости влияния учтенных факторов применяли критерий Фишера (F-критерий, отношение вариансы учтенного фактора к остаточной вариансе) для соответствующего числа степеней свободы (df). Достоверности различий средних значений признаков по сравниваемым группам генотипов определяли с помощью t-критерия Стьюдента для соответствующего числа степеней свободы и уровней доверительной вероятности ***p ≤ 0,001; ** – p ≤ 0,01; * – p ≤ 0,05. Расчеты для дисперсионного анализа и по методу наименьших квадратов (LSM, least square means) проводили в программе STATISTICA 10 (StatSoft, Inc., США).
Результаты (Results)
Идентификацию аллелей по гену SCD проводили в режиме реального времени при помощи тест-системы, принцип действия которой основан на использовании двух специфических праймеров SCD-RT-F и SCD-RT-R и двух аллель-специфичных зондов, помеченных флуоресцентными метками. Зонд, предназначенный для идентификации аллеля T, ассоциированного с повышенным содержанием ВМЖ у свиней, помечен красителем FAM, а зонд для идентификации аллеля С помечен красителем R6G.
На рисунке показаны результаты генотипирования SCD.
Рис. Результаты генотипирования свиней по SCD методом ПЦР-РВ. А – генотип TT, B – генотип TС, C – генотип СС
Fig. RT-PCR genotyping results for SCD. A – genotype TT, B – genotype TС, C – genotype CC
На рисунке показано, что у гетерозиготных особей детектируется сигнал и по красителю FAM и по красителю R6G (рис. Б). У гомозиготных TT вариантов фиксируется сигнал по красителю FAM (рис. A), гомозиготных особей с СС вариантом детектируется сигнал по красителю R6G (рис. В). Результаты генотипирования с использованием тест-системы диагностики полиморфизма гена SCD демонстрируют ее пригодность для рутинного применения.
Проводили исследование частоты аллелей и генотипов в исследуемых группах свиней по гену SCD. В таблице 1 представлены результаты распределения частот в группах свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок.
Таблица 1
Распределение частот генотипов и аллелей по SCD
|
Порода |
Частоты генотипов |
Частоты аллелей |
|||
|
TT |
TC |
CC |
T |
C |
|
|
Крупная белая |
46,8 |
43,6 |
9,6 |
0,686 |
0,314 |
|
Ландрас |
100 |
0 |
0 |
1,0 |
0 |
|
Дюрок |
12,7 |
58,5 |
28,8 |
0,419 |
0,581 |
Table 1
Genotype and allele frequencies of SCD gene
|
Breed |
Genotype frequencies |
Allele frequencies |
|||
|
TT |
TC |
CC |
T |
C |
|
|
Large white |
46.8 |
43.6 |
9.6 |
0.686 |
0.314 |
|
Landrace |
100 |
0 |
0 |
1.0 |
0 |
|
Duroc |
12.7 |
58.5 |
28.8 |
0.419 |
0.581 |
Анализ распределения частот аллелей и генотипов продемонстрировал, что свиньи пород крупная белая и дюрок характеризовались наличием полиморфизма в позиции g.2228 T > C гена SCD. Частота аллеля T, связанного с десатурацией жира в мышцах и подкожной жировой клетчатке у дюрока, составила в исследуемой нами популяции 0,419. Генотип ТТ встречался в этой группе с частотой 12,7 %. Свиньи крупной белой породы характеризовались частотой аллеля Т на уровне 0,686, генотипа ТТ – 46,8 %. У свиней породы ландрас полиморфизма в данной позиции выявлено не было, все исследованные животные являлись носителями генотипа TT.
Результаты оценки по признакам содержания внутримышечного жира, а также показателям толщины шпика и постности представлены в таблице 2.
Таблица 2
Взвешенные значения оценок генотипов по SCD, полученные методом наименьших квадратов (LSM), по изучаемым признакам свиней пород крупная белая и ландрас
|
Группа |
N количество |
SCD генотип |
ВМЖ, % |
Толщина шпика, мм |
Постность, % |
Живая масса, кг |
|
M ± m |
M ± m |
M ± m |
M ± m |
|||
|
Д_m |
13 |
TT |
2,20 ± 0,16а,б |
12,35 ± 0,75а,в |
61,30 ± 1,49 |
102,47 ± 2,24 |
|
64 |
CT |
2,59 ± 0,07а |
14,37 ± 0,34а,б |
61,42 ± 0,67 |
104,54 ± 1,01 |
|
|
26 |
CC |
2,62 ± 0,11б |
15,77 ± 0,53б,в |
62,49 ± 1,05 |
102,62 ± 1,59 |
|
|
F-критерий |
2,650,1 |
8,32*** |
0,38 |
0,74 |
||
|
Д_f |
2 |
TT |
2,55 ± 0,41 |
18,85 ± 1,91 |
68,95 ± 3,79 |
104,30 ± 5,72 |
|
12 |
CT |
2,93 ± 0,17 |
14,98 ± 0,78 |
69,23 ± 1,55 |
107,46 ± 2,34 |
|
|
13 |
CC |
2,91 ± 0,16 |
14,61 ± 0,75 |
65,78 ± 1,49 |
102,11 ± 2,24 |
|
|
F-критерий |
0,55 |
1,45 |
1,35 |
1,06 |
||
|
КБ |
8 |
TT |
1,99 ± 0,20 |
13,18 ± 0,96 |
58,68 ± 1,89 |
105,98 ± 2,86 |
|
17 |
CT |
2,14 ± 0,14 |
14,43 ± 0,66 |
59,58 ± 1,30 |
106,66 ± 1,96 |
|
|
5 |
CC |
2,54 ± 0,26 |
15,78 ± 1,21 |
57,86 ± 2,40 |
115,24 ± 3,62 |
|
|
F-критерий |
1,31 |
1,28 |
0,30 |
3,110,1 |
||
*** Величина критерия Фишера статистически значима при р ≤ 0,001; 0,1 – тенденция.
а, б Различия между отмеченными генотипами статистически значимы при p ≤ 0,05; в при Р ≤ 0,001.
Table 2
Least-Squares Means (LSM) SCD genotype scores of the studied traits of Large White and Landrace pig breeds
|
Group |
N Sampling rate |
SCD genotype |
Intramuscular fat content, % |
Thickness of bacon, millimeters |
Lean, % |
Live weight, kg |
|
M ± m |
M ± m |
M ± m |
M ± m |
|||
|
D_m |
13 |
TT |
2,20 ± 0,16а,b |
12,35 ± 0,75а,c |
61,30 ± 1,49 |
102,47 ± 2,24 |
|
64 |
CT |
2,59 ± 0,07а |
14,37 ± 0,34а,b |
61,42 ± 0,67 |
104,54 ± 1,01 |
|
|
26 |
CC |
2,62 ± 0,11b |
15,77 ± 0,53b,c |
62,49 ± 1,05 |
102,62 ± 1,59 |
|
|
F-test |
2,650,1 |
8,32*** |
0,38 |
0,74 |
||
|
D_f |
2 |
TT |
2,55 ± 0,41 |
18,85 ± 1,91 |
68,95 ± 3,79 |
104,30 ± 5,72 |
|
12 |
CT |
2,93 ± 0,17 |
14,98 ± 0,78 |
69,23 ± 1,55 |
107,46 ± 2,34 |
|
|
13 |
CC |
2,91 ± 0,16 |
14,61 ± 0,75 |
65,78 ± 1,49 |
102,11 ± 2,24 |
|
|
F-test |
0,55 |
1,45 |
1,35 |
1,06 |
||
|
LW |
8 |
TT |
1,99 ± 0,20 |
13,18 ± 0,96 |
58,68 ± 1,89 |
105,98 ± 2,86 |
|
17 |
CT |
2,14 ± 0,14 |
14,43 ± 0,66 |
59,58 ± 1,30 |
106,66 ± 1,96 |
|
|
5 |
CC |
2,54 ± 0,26 |
15,78 ± 1,21 |
57,86 ± 2,40 |
115,24 ± 3,62 |
|
|
F-test |
1,31 |
1,28 |
0,30 |
3,110,1 |
||
*** The value of the Fisher test is statistically significant at p ≤ 0.001; 0.1 - a trend.
a, b Differences between the marked genotypes are statistically significant at p ≤ 0.05; с at p ≤ 0.001.
Анализ взвешенных значений оценок генотипов по SCD, полученных методом наименьших квадратов (LSM) выявил статистически значимое превосходство носителей аллеляС по содержанию внутримышечного жира. Разница между хряками породы дюрок с генотипами ТТ и СС составила 0,42 % и была значима при Р ≤ 0,05. В группе животных крупной белой породы наблюдалась подобная зависимость, но различия не были статистически значимы. Наиболее выражена разница по толщине шпика у хряков породы дюрок, носители генотипа СС превосходили особей с генотипом ТТ более чем на 3 мм (при Р ≤ 0,001). Таким же образом распределились генотипы у свиней породы крупная белая CC ˃ TC ˃ TT. В группе свинок породы дюрок статистически значимых различий по показателям продуктивности с учетом генетических вариантов не обнаружено.
Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)
Анализ частоты распределения аллелей и генотипов по гену SCD показал в нашем случае отсутствие носителей генотипа TT и аллеля Т среди свиней породы ландрас, что согласуется с результатами Estany J. и коллег [3, c. 4]. Частота аллеля T в популяции свиней породы дюрок составила 0,462, что было сопоставимо с выявленной нами частотой 0,419. По свиньям крупной белой породы отмечены различия в частоте аллеля Т между исследуемой нами группой – 0,686 против 0,951. С высоким потенциалом десатурации и благоприятным профилем жирных кислот и параметрами качества мяса связан аллель Т по SCD, который встречается с высокой частотой в большинстве популяций [18, c. 13].
Имеются сведения, что повышенный уровень экспрессии SCD идентифицирован у животных с меньшей мраморностью [17, с. 12]. А также не показано однозначного влияния полиморфизма в позиции g.2228 T > C гена SCD на содержание внутримышечного жира. Поиск ассоциаций генетических вариантов по гену SCD с признаками продуктивности в наших исследованиях показал статистически значимое превосходство носителей СС генотипа по толщине шпика в группе хряков породы дюрок. Полиморфизм g.2228 T > C гена SCD, расположенный в промоторе, не оказывал существенного влияния на толщину шпика в популяции дюрок, что указывает на возможное отсутствие влияния данной мутации на экспрессию SCD. Желательным в аспекте влияния на состав жирных кислот считают аллель Т. В нашем исследовании было обнаружено превосходство хрячков породы дюрок с генотипом СС по содержанию ВМЖ. По результатам Henriquez-Rodriguez и коллег [15, c. 41], особи с СС генотипом по данному показателю также несколько превосходили носителей других генетических вариантов. Henriquez-Rodriguez и коллеги [19, с. 2555] исследовали комбинированное влияние потребления каротиноидов провитамина А (PVA) и генотипа SCD (AY487830: g.2228 T > C) на содержание ретиноидов в печени, мышцах и показали статистически значимое влияние генотипа по SCD на признаки продуктивности у свиней породы дюрок. Ряд полногеномных ассоциативных исследований [16, с. 17; 20, с. 5; 21, с. 1130; 22, с. 170] позволил идентифицировать значимые для признаков состава и содержания внутримышечного жира у свиней различных пород QTL, геном-кандидатом для которых является SCD, что в очередной раз подтверждает роль данного гена в формировании признаков, характеризующих качество мяса. Вместе с тем, несмотря на существенную роль SCD в метаболизме липидов, и влиянии на десатурацию аллеляT, нами была обнаружена зависимость между признаками содержания внутримышечного жира и толщины шпика у хряков породы дюрок и генотипом СС. Тем не менее, по некоторым данным [17, с. 14], фиксировался породоспецифичный характер уровня экспрессии SCD.
Таким образом, наши результаты подтверждают наличие ассоциации генотипа по SCD с содержанием внутримышечного жира и толщины шпика у хряков породы дюрок. Полученные в группах свинок породы дюрок и хряков породы крупная белая различия между генетическими вариантами по SCD и мясными качествами следует уточнить на большом числе особей. В целом для хряков породы дюрок ген SCD может рассматриваться в качестве ДНК-маркера содержания внутримышечного жира.
Благодарности (Acknowledgements)
Работа была проведена в рамках выполнения задания министерства науки и высшего образования Российской Федерации ГЗ № АААА-А18-118021590138-1.
