сотрудник
Москва, г. Москва и Московская область, Россия
сотрудник
Москва, г. Москва и Московская область, Россия
сотрудник
Москва, г. Москва и Московская область, Россия
сотрудник
Москва, г. Москва и Московская область, Россия
сотрудник
Москва, г. Москва и Московская область, Россия
сотрудник
Москва, г. Москва и Московская область, Россия
Основой новой стратегии лечения инфекционных заболеваний животных является модуляция иммунного ответа организма хозяина для усиления клиренса инфекционных агентов и уменьшения повреждающего действия процессов, связанных с воспалением в тканях. Современный подход к применению иммуномодуляторов (ИМД) в ветеринарной практике основан на использовании таких препаратов, которые помимо собственно иммуномодулирующей активности обладают, в частности, противовирусными, антиоксидантными, противовоспалительными, гемостимулирующими и/или иными важными свойствами. В связи с этим, актуальной задачей представляется поиск возможной противовирусной активности у ряда известных ИМД. Цель исследования: выявить возможную противовирусную активность известного ИМД глутоксима (ГЛТ) при инфицировании линий диплоидных клеток фибробластов человека (ЛДКФЧ) М-8 и М-22 вирусом везикулярного стоматита (ВВС). Материалы и методы: использовали ВВС (штамм Индиана). Антивирусную активность ГЛТ исследовали: 1) в дозах, рекомендованных для опытов in vitro ― 1, 4 и 8 мкг/мл; 2) в низких дозах ― 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл. ГЛТ в исследуемых концентрациях вносили в клеточный монослой по профилактической (за 24 ч до заражения вирусом клеток) и лечебной (одновременно с инфицированием ВВС ЛДКФЧ) схемам. Противовирусную активность ГЛТ оценивали по следующим критериям: способность препарата предотвращать развитие вирусного цитопатогенного действия (ЦПД), ингибировать репродукцию ВВС в ЛДКФЧ, наличие вирулицидного действия. Результаты: показано, что ГЛТ в концентрациях 1, 4, 8 мкг/мл, рекомендованных для опытов in vitro, не задерживал развитие специфического вирус-индуцированного ЦПД в клетках. При этом титры вируса в инфицированных клетках в присутствии ГЛТ не отличались от таковых в контрольных ЛДКЧФ, инфицированных ВВС без добавления препарата на всем протяжении эксперимента. Препарат не обладал вирулицидным действием в отношении ВВС. Обработка ЛДКФЧ ГЛТ в концентрациях 0,1, 0,25 и 0,5 мг/мл приводит к значительному (более, чем в 100 раз) подавлению репликации ВВС в ЛДКФЧ М-22 через 24 ч после инфицирования клеток вирусом. Через 40 и 48 ч противовирусный эффект ГЛТ во всех использованных дозах не выявляется. Таким образом, впервые установлено, что ГЛТ обладает противовирусным действием in vitro, проявляющимся через 24 ч после заражения.
глутоксим, вирус везикулярного стоматита, иммуномодулятор, антивирусное действие, клеточная линия фибробластов, фоспренил, интерферон
Сокращения: ВВС ― вирус везикулярного стоматита, ГЛТ ― глутоксим, ИЛ ― интерлейкин, ИМД ― иммуномодулятор, ИФН ― интерферон, ЛДКФЧ ― линии диплоидных клеток фибробластов человека, ТЦД ― тканевая цитопатогенная доза, ФНО ― фактор некроза опухоли, ФП ― фоспренил, ЦПД ― цитопатогенное действие, ЦТ ― цитокины.
Введение
Основой новой стратегии лечения инфекционных заболеваний животных является модуляция иммунного ответа организма хозяина для усиления клиренса инфекционных агентов и уменьшения повреждающего действия процессов, связанных с воспалением в тканях. Современный подход к применению ИМД в ветеринарной практике предполагает преимущественное использование таких препаратов, которые помимо собственно иммуномодулирующей активности обладают, в частности, противовирусными, антиоксидантными, противовоспалительными, гемостимулирующими и/или иными важными свойствами. В связи с этим, актуальной задачей представляется поиск возможной противовирусной активности у ряда известных ИМД.
Цель исследования
Изучить противовирусное действие такого ИМД, как ГЛТ, разрешенного к клиническому применению в качестве противоинфекционного лекарственного средства [1, 2]. В качестве препарата сравнения использовали ФП, который представляет собой ИМД с противовирусным и противовоспалительным действием, широко используемый в ветеринарной практике [9, 11].
Материалы и методы
Вирус. Использовали ВВС, штамм Индиана, полученный из банка вирусов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. ВВС пассировали и титровали в ЛДКЧФ М-22 и М-8 и выражали в lg ТЦД50 [7].
ЛДКЧФ. Опыты проводили на ЛДКЧФ М-22 и М-8 из коллекции клеточных культур ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН».
ИМД. Препарат ГЛТ в виде стерильного, лиофилизированного порошка (ЗАО «Фарма ВАМ», Государственный завод медицинских препаратов ФГУП, Россия). Перед употреблением содержимое флакона растворяли в среде поддержки. Препарат ФП (ЗАО «Микро-плюс», серия №1213) разводили средой №199 на растворе Эрла рН=7,6 до концентрации 100 мкг/мл и наносили на монослой клеток. В качестве положительного контроля использовали коммерческий человеческий лейкоцитарный интерферон (производитель: «Биомед», Пермь, Россия) в дозе 100 МЕ/мл.
Испытание цитотоксического действия и противовирусной активности препаратов проводили на монослойной культуре клеток М-22 и М-8 с использованием 96-луночных планшет (фирмы «Costar», GB), которые инкубировали при 37о С и 5 % СО2.
Цитотоксическое действие препаратов на клетки определяли однократным внесением в культуру клеток М-22 и М-8: а) формирующую монослой, б) достигшую монослоя (24 ч). Токсичность определяли посредством световой микроскопии по степени изменения морфологии клеточного монослоя и контролировали в течение 96 ч.
Противовирусную активность ГЛТ оценивали по следующим критериям: предотвращение развития вирусного ЦПД, подавление репродукции ВВС в ЛДКФЧ, вирулицидное действие. Статистическую обработку проводили по Фишеру [6].
Результаты
Изучение токсичности ГЛТ в отношении клеток М-22 и М-8. Проведенные исследования показали, что в концентрациях 1, 4 и 8 мкг/мл препарат ГЛТ не замедляет клеточного роста и не вызывает видимых цитопатических изменений монослоя клеток М-22 и М-8. По данным теста с трипановым синим, процент жизнеспособных клеток, инкубированных в течение 96 ч в присутствии различных концентраций препарата ГЛТ, практически не отличался от такового у контрольных клеток. Полученные результаты полностью согласуются с данными о нетоксичности препарата ГЛТ в исследованных концентрациях для культур клеток [12].
Изучение вирулицидного действия ГЛТ. Независимо от использованной в опытах концентрации, после совместной инкубации с тест-вирусом при 37 о С в течение 1 ч в соотношении 1:1, препарат не влиял на внеклеточные вирионы и не снижал титр вируса, по сравнению с аналогичным показателем в контроле у вируса, находившегося в тех же условиях, но не обработанного ГЛТ.
Профилактическая схема применения ГЛТ на модели инфекции, вызванной ВВС in vitro. ГЛТ, внесенный в концентрациях 1, 4 и 8 мкг/мл за 24 ч до заражения не приводил к задержке развития вирусного ЦПД в лунках с множественностью заражения 0,1 – 0,01 ‒ 0,001 ЦПД50/клетку и не снижал титра вируса (табл. 1). Таким образом, ГЛТ не обладал противовирусным действием при его использовании по профилактической схеме.
Выявление противовирусной активности ГЛТ, использованного по лечебной схеме. ЛДКЧФ М-22 или М-8 инокулировали ГЛТ в концентрациях 1, 4, 8 мкг/мл в составе поддерживающей среды одновременно с заражением ВВС. Данные, представленные в таблице 1, показывают, что ГЛТ в данных дозах не подавляет размножение ВВС. Напротив, ФП снижал титр ВВС на 1,75 lg ТЦД50 по сравнению с контролем. Ежедневное (в течение 3-х суток) визуальное наблюдение за клетками, зараженными ВВС и обработанными ГЛТ, показало, что ГЛТ в указанных дозах не задерживал развитие вирус-индуцированного ЦПД в клетках. При этом титры вируса в инфицированных клетках в присутствии ГЛТ не отличались от таковых в контрольных ЛДКЧФ, инфицированных ВВС без добавления препарата.
1. Противовирусная активность препаратов ГЛТ и ФП в отношении вируса везикулярного стоматита в ЛДКЧФ М-22 и М-8
1. Antiviral activity of GLT and Phosprenyl against vesicular stomatitis virus in M-22 and M-8 cell lines
|
Препарат |
Профилактическая схема |
Лечебная схема
|
|
Титр / снижение титра, lg ТЦД50 |
||
|
ГЛТ, 1 мкг/мл |
4,5 / ‒ |
4,75 / ‒ |
|
ГЛТ, 4 мкг/мл |
4,5 / ‒ |
5,00 / ‒ |
|
ГЛТ, 8 мкг/мл |
4,5 / ‒ |
4,75 / ‒ |
|
ФП, 100 мкг/мл |
3,5 / 1,0 |
3,00 / 1,75 |
|
Интерферон, 100 МЕ |
0,00 / 4,5 |
0,00 / 4,75 |
|
Контроль вируса, lg ТЦД50 |
4,5 |
4,75 |
|
|
|
|
Выявление антивирусного действия ГЛТ в низких концентрациях. Нас заинтересовал вопрос о возможном противовирусном эффекте ГЛТ при обработке клеток дозами препарата ниже рекомендованных для опытов in vitro [1, 4]. В следующей серии экспериментов клетки линии М-22 были обработаны ГЛТ в концентрациях 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл в составе поддерживающей среды с последующим заражением ВВС (по лечебной схеме). Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что ГЛТ значительно подавляет развитие ЦПД ВВС в ЛДКФЧ: через 24 ч титры ВВС в контроле достигают 3,5 lg ТЦД50, а в клетках, обработанных ГЛТ в концентрациях 0,1; 0,25 и 0,5 мг/мл ― 1 lg ТЦД50, 1,75 lg ТЦД50 и 1,75 lg ТЦД50, соответственно. Таким образом, ГЛТ в минимальной дозе (0,1 мкг/мл) обладает способностью подавлять размножение ВВС в ЛДКФЧ более чем в 100 раз. Через 40 и 48 ч противовирусный эффект ГЛТ во всех использованных дозах не выявляется (см. табл. 2).
2. Влияние ГЛТ в низких концентрациях на размножение вируса везикулярного стоматита в клетках М-22
2. Effect of GLT in low doses on reproduction of vesicular stomatitis virus in M-22 cells
|
Доза ГЛТ, мкг/мл |
Титр после заражения / снижение титра, lg ТЦД50 |
||
|
через 24 ч |
через 40 ч |
через 48 ч |
|
|
0,1
|
1,00 /2,5 |
4,5 / ‒ |
5,0 / ‒ |
|
0,25 |
1,75 / 1,75 |
4,0 / ‒ |
4,75 / ‒ |
|
0,5 |
1,75 / 1,75 |
3,75 / 0,25 |
4,75 / ‒ |
|
Контроль вируса, lg ТЦД50 |
3,5 |
4,0 |
4,75 |
Обсуждение
ГЛТ является фармакологическим аналогом естественного метаболита ― окисленного глутатиона. Это химически синтезированный гексапептид (бис-(гамма-L- глутамил)-L-цистеинил-бис-глицин динатриевая соль), в котором искусственная стабилизация дисульфидной связи позволяет многократно усилить физиологические эффекты, присущие предшественнику ― естественному окисленному глутатиону. ГЛТ стимулирует каскадные механизмы фосфатной модификации основных белков сигнал-передающих систем, способствует синтезу цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО, ИФН, индуцирует экспрессию рецепторов ИЛ-2 [2]. Подобно ФП, ГЛТ оказывает иммуномодулирующее, гемостимулирующее, детоксицирующее, гепатопротекторное и антиоксидантное действие [2, 10, 12]. Препарат также стимулирует кальциевый сигнал в макрофагах [5, 8]. Иммуномодулирующие свойства ГЛТ и способность стимулировать продукцию эндогенных ИФН и других ключевых ЦТ обосновывают проведение исследований по выявлению его возможной антивирусной активности. Однако сведений о его противовирусном эффекте не имеется. Отсутствуют также данные о способности препарата усиливать действие средств противовирусной терапии.
Адекватной моделью для выявления антивирусной активности ИМД и изучения механизмов их действия являются ЛДКФЧ. Фибробласты рассматриваются как потенциально иммунорегуляторные клетки, функционально эквивалентные мезенхимальным стволовым клеткам [13]. ЛДКФЧ и первичные фибробласты широко используются для изучения молекулярных механизмов иммунопатогенеза вирусных инфекций и противовирусной активности ИМД [14]. ЛДКФЧ обладают способностью продуцировать ИФНы I типа и другие ЦТ; ВВС ― ИФН-чувствительный вирус, поэтому использование ВВС-инфекции ЛДКФЧ в качестве модели для выявления возможной антивирусной активности ГЛТ представляется адекватным. Данная модель была успешно использована нами при исследовании противовирусной и интерфероногенной активности различных ИМД, в том числе ФП [3].
В настоящей работе представлены данные о выявлении противовирусной активности ГЛТ при инфицировании ЛДКФЧ М-8 и М-22 вирусом везикулярного стоматита. В серии экспериментов с использованием ГЛТ в дозах 1, 4 и 8 мкг/мл нам не удалось выявить антивирусную активность препарата, использованного как по лечебной, так и по профилактической схеме. Иная картина наблюдается при обработке ЛДКФЧ ГЛТ в концентрациях 0,1; 0,25 и 0,5 мг/мл. Через 24 ч после инфицирования ЛДКФЧ М-22 ВВС регистрируется значительное (более чем в 100 раз) подавление репликации вируса под воздействием ГЛТ (см. табл. 2).
Обращает на себя внимание тот факт, что в работах по исследованию действия ГЛТ in vitro положительные результаты достигались при использовании достаточно высоких доз препарата: 1, 4, 8, 16, 32, 64 мкг/мл и выше [1, 4]. При этом не наблюдалось токсического эффекта ГЛТ при обработке препаратом макрофагов или нейтрофилов [4]. Напротив, мы показали, что ГЛТ в концентрациях 16 мкг/мл и выше проявлял токсичность в отношении ЛДКФЧ, что, по-видимому, объясняется различиями в чувствительности к препарату клеток разного происхождения. В нашей работе впервые показано, что ГЛТ обладает способностью подавлять размножение ВВС в ЛДКФЧ через 24 ч после заражения. Впервые установлено также, что на более поздних сроках (через 40 и 48 ч) после заражения клеток вирусом препарат ГЛТ не только не проявляет антивирусной активности, но и способствует усилению репродукции ВВС в культуре клеток. Поскольку ГЛТ обладает свойствами ИМД, в том числе стимулирует продукцию эндогенных ИФН, логично предположить, что противовирусный эффект препарата в отношении репродукции ВВС в ЛДКФЧ связан с его интерфероногенной активностью. Для проверки данного предположения мы проводим дальнейшие исследования иммуномодулирующих свойств ГЛТ в ЛДКФЧ.
Вывод
Впервые установлено, что ГЛТ обладает противовирусным действием in vitro, проявляющимся через 24 ч после заражения.
Конфликт интересов
Авторский коллектив не получал спонсорской помощи от производителей или поставщиков оборудования и расходных материалов, указанных в данной работе.
1. Васильева, С.Н. Экспериментальное обоснование использования Глутоксима в качестве средства сопровождения этиотропной терапии генерализованного туберкулеза / С.Н. Васильева: автореф. дис. … канд. мед. наук (защищена 14.03.2007), ― СПб.: НИИ фтизиопульманологии, 2007. ― С 22.
2. Инструкция по медицинскому применению препарата Глутоксим; Патент RU N 2 498 821 C1. Режим доступа: http://www.glutoxim.ru.
3. Конюшко, О.И., Экспрессия генов интерферонов в культуре фибробластов человека при воздействии иммуномодуляторов и при вирусной инфекции / О.И. Конюшко, С.В. Ожерелков, Е.В. Хитрина, А.В. Саличев, Т.Н. Кожевникова, А.В. Санин // Молекулярная медицина. ― 2016. ― Т. 14. ― № 5. ―С. 43‒49.
4. Куничан, А.Д. Влияние глутоксима на рост лекарственноустойчивых микобактерий туберкулеза при его сочетании с противотуберкулезными препаратами второго ряда в культуре легочной ткани мышей / А.Д. Куничан, Г.Б. Соколова, М.И. Перельман // Антибиотики и Химиотерапия. ― 2002. ― Т. 47. ― № 6. ― С. 18–21.
5. Курилова, Л.С. Влияние окисленного глутатиона и его фармакологического аналога препарата Глутоксим на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах / Л.С. Курилова, Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Антонов В.Г. // Цитология. ― 2008. ― Т. 50. ― №5.― С. 452‒461.
6. Лакин, Г.Ф. Биометрия. ― М: Высшая школа, 1990. ― 352 с.
7. Леннет, Э.H. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний / Э.H. Леннет, Н. Шмидт. ― М.: Медицина, 1974. ― С. 42–46.
8. Naumova, A.A. Sigma-1 receptors are involved in modulation of Ca2+ responses induced by glutoxim and molixan in macrophages / A.A. Naumova, Z.I. Krutetskaya, L.S. Milenina, A.V. Melnitskaya, N.I. Krutetskaya, S.N. Butov, V.G. Antonov // The FEBS Journal. ― 2017. ― Vol. 284. ― suppl. 1. ― рр. 228‒229.
9. Санин, А.В. Применение иммуномодуляторов при вирусных заболеваниях мелких домашних животных/ А.В. Санин, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин // Ветеринария и кормление. ― 2017.― № 3. ― С. 95‒97.
10. Санин, А.В. Изучение антиоксидантных свойств Фоспренила в различных биологических тест-системах / А.В. Санин, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, Т.Н. Кожевникова, В.Ю. Санина, А.Д. Агафонова // Российский ветеринарный журнал. ― 2017 ― № 10 ― С. 28‒31.
11. Санин, А.В. Исследование противовоспалительной активности фоспренила в эксперименте / А.В. Санин, С.А. Суханова, О.В. Проскурина, Н.М. Митрохин, И.В. Ганшина, Г.Ф. Судьина, В.Ю. Санина, А.А. Виденина, Т.Н. Кожевникова, А.А. Санин, С.В. Ожерелков, А.В. Саличев, А.В. Пронин, А.Н. Наровлянский // Российский ветеринарный журнал, МДЖ. ― 2011. ― № 4. ― С. 17‒20.
12. Easton, D.M. Potential of immunomodulatory host defense peptides as novel anti-infectives / D.M. Easton, A. Nijnik, M.L. Mayer, R.E.W. Hancock // Trends in Biotechnology. ― 2009. ― Vol. 27. ― No. 10. ― pp. 582‒590.
13. Haniffa, M. Adult Human Fibroblasts Are Potent Immunoregulatory Cells and Functionally Equivalent to Mesenchimal Stem Cells / M. Haniffa, AXiao-nong Wang, U. Holtick, R. Michelle, J.D. Isaacs, A.M. Dickinson, M.U.C. Hilkens, M.P. Collin // The Journal of Immunology. ― 2007. ― No. 179. ― pp. 1595‒1604.
14. Fang Li. Antiviral Effect of IDO in Mouse Fibroblast Cells During Influenza Virus Infection / Fang Li Håkan Karlsson // Viral Immunology. ― 2017. ― No. 30 (7) ― pp. 542‒544.
