Введение
Антоцианы – это водорастворимые гликозиды из класса флавоноидов, которые ответственны за красный, фиолетовый и синий цвета многих растений, фруктов, овощей и цветов [1, 2]. Помимо их участия в регуляции роста и развития растений, антоцианы обладают биологическими свойствами, влияющими на клетки живых организмов. Они проявляют мощные антиоксидантные свойства, что помогает защищать клетки от окислительного стресса и повреждения, вызванного свободными радикалами [1]. Это, в свою очередь, может снизить риск развития различных заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания [1]. Антоцианы также способствуют улучшению зрения, поддерживают здоровье сосудов и обладают противовоспалительным действием [2]. Основными представителями антоцианов являются цианидин, дельфинидин, пеларгонидин, пеонидин, петунидин и мальвидин [2, 3].
Как известно, экстракты многих плодовых растений содержат большое количество биологически активных веществ (полифенолы, фенольные кислоты, флавоноиды, антоцианы и проантоцианидины), которые обладают геропротекторным потенциалом [4]. Наибольшее количество антоцианов содержится в таких ягодах, как черноплодная рябина (Aronia melanocarpa) [5], черника (Vaccinium ashei) [6], ежевика (Rubus fruticosus L.), вишня (Prunus cerasus L.), черешня (Prunus avium L.), бузина (Sambucus nigra L.) [7], виноград (Vitis spp.), черная смородина (Ribes nigrum), слива (Prunus spp.), жимолость (Lonicera caerulea), клюква (Vaccinium macrocarpon), клубника (Fragaria spp.) [1, 8, 9], клубнях картофеля (Solanum tuberosum) и батата (Ipomoea batatas L.), корнеплоде черной моркови (Daucus carota L. ssp. sativus var. atrorubens Alef.) [10], а также в томатах (Solanum lycopersicum) [11] и черных соевых бобах (Glycine max (L.) Merr) [12].
Например, антоциановый экстракт клюквы (V. macrocarpon Ait.) в концентрации 20 мг/мл увеличивал среднюю продолжительность жизни Drosophila melanogaster на 10 % [13]. Экстракт терпкой вишни (Prunus cerasus), добавляемый в пищу с третьего дня жизни червей N2 дикого типа Caenorhabditis elegans, на протяжении всей жизни в концентрациях 6 и 12 мкг/мл увеличивал среднюю продолжительность жизни [14]. Экстракт пурпурного сладкого батата (Ipomoea batatas L.) в концентрации 0,5 мг/мл увеличивал среднюю продолжительность жизни самцов
D. melanogaster на 2,8 %, а 2,0 мг/мл – на 14,5 % [15]. Добавление в питательную среду взрослым (с четвертой по шестую недели) мухам D. melanogaster этанольного экстракта черноплодной рябины (×Sorbaronia mitschurinii) в концентрациях 0,1 и 5 мг/мл увеличивало максимальную продолжительность жизни самцов на 9 % [16]. Ацетоновый экстракт аронии черноплодной (Aronia melanocarpa) в концентрации 2,5 мг/мл увеличил на 18 % среднюю продолжительность жизни самцов D. melanogaster [17]. Метанольный экстракт пурпурной пшеницы (Triticum aestivum), богатый антоцианами, продлил среднюю продолжительность жизни C. elegans на 10,5 % [18]. Сок красной капусты (Brassica oleracea L. var. capitata L. f. Rubra) в различных концентрациях: 1 % (5 %), 2 (8), 3 (9) и 5 % (21 %) увеличивает среднюю продолжительность жизни C. elegans [19]. Экстракт черники (Vaccinium spp.) увеличил среднюю и максимальную продолжительность жизни самцов дрозофил дикого типа Oregon-RC на 5 % [20].
Более того, исследования показали, что отдельные биологически активные вещества, содержащиеся в растениях, также могут оказывать положительное влияние на продолжительность жизни модельных организмов. Например, антоциан цианидин-3-глюкозид (C3G) в концентрациях 10 и 100 мкМ увеличивает максимальную продолжительность жизни самцов на 3 и 8 % соответственно у D. melanogaster [21]. Пеонидин-3-глюкозид в концентрации 50 мкг/мл увеличивал продолжительность жизни C. elegans на 14 %. Кроме того, этот антоциан повышал устойчивость червя к неблагоприятным условиям внешней среды, таким как ультрафиолетовое излучение (UVA), гипертермия и перекись водорода. При воздействии UVA и термическом стрессе устойчивость червя повышалась на 25 %, а при окислительном стрессе – на 48 % [22].
Антоцианы представляют собой большой класс соединений, которые мы регулярно употребляем с пищей, и изучение вызываемых ими биологических эффектов является важным шагом для определения потенциальных геропротекторов, которые могут быть использованы для разработки целевых стратегий улучшения здоровья и продления жизни. В настоящем исследовании мы предложили гипотезу о том, что природный антоциан дельфинидин обладает высоким потенциальным геропротекторным эффектом, и проверили ее в исследовании на модельном организме Drosophila melanogaster.
Материалы и методы
Выделение природного антоциана из плодов. Выделение дельфинидина-3-О-глюкозида проводили из плодов жимолости Палласа (Lonícera pallacii L.). Для получения экстракта жимолости Палласа 10 г размороженных ягод были раздавлены стеклянной палочкой и помещены
в коническую колбу объемом 250 мл. Далее к ним был добавлен раствор 10%-ной соляной кислоты с 5%-ным этиловым спиртом (100 мл). Экстракцию сырья осуществляли три раза, обрабатывая ягодную массу раствором 10%-ной соляной кислоты в соотношении 10 частей раствора на
1 часть сырья. Экстракцию проводили в темном месте при температуре +25 ºС в течение суток. Полученные элюаты отфильтровывали, объединяли и упаривали на роторном испарителе (Heidolph, Германия) при температуре 35–40 °C до консистенции густого сиропа, после чего лиофильно высушивали. Полученный сухой экстракт представлял аморфное порошкообразное вещество темно-красного цвета.
Получение дельфинидин-3-О-глюкозида. Для разделения суммарного экстракта антоцианов жимолости колонку, заполненную сорбентом с обращенной фазой Диасорб 130С16Т, промывали начальным элюентом – 10%-ным раствором дегазированной муравьиной кислоты. После чего вносили экстракт массой 1 г, растворенный в 10%-ном растворе муравьиной кислоты, и проводили хроматографическое разделение на фракции растворами ацетонитрила в воде (10%-ный раствор муравьиной кислоты) в соотношениях 0:100, 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88. В ходе разделения суммарного экстракта получены: дельфинидин-3-О-глюкозид. Структуры выделенных веществ были доказаны физико-химическими методами исследования (ЯМР, ВЭЖХ-МС). Полученный дельфинидин был передан для биохимического испытания. В дальнейших экспериментах с применением дельфинидина-3-О-глюкозида
и его различных концентраций в качестве разбавителя использовали дистиллированную воду.
Условия содержания Drosophila melanogaster. В экспериментах использовали линию Drosophila melanogaster дикого типа Canton-S (#64349, Блумингтон, США). Мух содержали в камере постоянного климата Binder KBF720-ICH (Binder, Германия) при температуре +25 °C и относительной влажности 60 %, с режимом освещения 12 ч свет: 12 ч темнота. Питательная среда, на которой жили мухи, содержала воду – 1 л, кукурузную муку – 92 г, сухие дрожжи – 32,1 г,
агар-агар – 5,2 г, глюкозу – 136,9 г. Для предотвращения роста плесени и бактерий на 1 л среды добавляли 10 мл 10%-ного раствора нипагина (метил 4-гидроксибензоат, Merck, США) в этаноле и 10 мл 50%-ной пропионовой кислоты (Merck, США). Водные растворы дельфинидина в концентрациях 1, 10 и 100 мкМ наносили непосредственно на поверхность свежей застывшей питательной среды в объеме 30 мкл. На поверхность питательной среды контрольных вариантов наносили 30 мкл воды. Далее поверхность среды просушивали под вентилятором.
Анализ продолжительности жизни. Для анализа продолжительности жизни (далее – ПЖ) имаго разделяли по полу, на каждый вариант эксперимента отбирали по 150 особей, помещая по 30 особей в каждую пробирку. Самцов и самок содержали раздельно. Эксперименты проводили в двух независимых повторностях. Рассчитывали медианную и максимальную (возраст 90 % смертности особей) продолжительности жизни.
Статистический анализ полученных результатов. Для анализа статистических различий в функциях выживаемости между контрольной и экспериментальной группой использовали модифицированный критерий Колмогорова-Смирнова. Критерии Гехана-Бреслоу-Вилкоксона
и Мантеля-Кокс применяли для анализа статистической значимости различий по медианной продолжительности жизни. Для оценки различий в возрасте 90 % смертности использовали тест Ванг-Эллисона [23]. Статистический анализ данных был выполнен с использованием программного обеспечения R, версии 2.15.1 (The R Foundation, США), Excel (Microsoft, США) и OASIS 2 (Online Application for Survival Analysis 2) [24].
Результаты и их обсуждение
Известно, что старение происходит планомерно, но при воздействии различных неблагоприятных факторов продолжительность жизни может резко сократиться за счет активации внутренних воспалительных процессов и накопления повреждений ДНК, приводящих к усугублению разнообразных заболеваний [25]. Поэтому для улучшения и продления здорового состояния организма применяют биологически активные вещества, обладающие геропротекторным потенциалом (http://geroprotectors.org/). К основным критериям геропротекторов относят: положительный эффект на продолжительность жизни модельных организмов, улучшение биомаркеров старения и качества жизни, низкую токсичность и минимальные побочные эффекты [26]. В качестве дополнительных критериев геропротекторов рассматривают эволюционно консервативные механизмы эффектов, воспроизводимые на различных моделях, способность отсрочивать развитие возрастных заболеваний и повышать устойчивость организма к неблагоприятным факторам окружающей среды [26].
Нами установлено, что природный антоциан дельфинидин вызывает статистически значимое снижение медианной продолжительности жизни самцов на 5 и 4 % при концентрациях 10 и 100 мкМ соответственно, что отображается сдвигом кривых влево по отношении к контрольной линии (рисунок А, таблица). При этом, дельфинидин в концентрации 10 мкМ увеличивал медианную продолжительность жизни самок на 4 %, в подтверждение этому отмечен сдвиг кривой смертности данного варианта эксперимента вправо по отношению к контрольной кривой (рисунок Б, таблица).
Ранее обнаружено, что дельфинидин-3-глюкозид увеличивает среднюю продолжительность жизни и улучшает состояние здоровья (увеличение средней скорости сокращений глоточного насоса) C. elegans, даже в условиях окислительного стресса, вызванного H2O2 [27]. А также выявлено, что дельфинидин-3-рутинозид, выделенный из плодов черной смородины (Ribes nigrum), облегчает расслабление цилиарной мышцы, тем самым отсрочивая развитие близорукости у крупного рогатого скота [28]. У мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров одновременно с цианидином и дельфинидином в дозе 40 мг/кг в условиях окислительного стресса, повышались уровни экспрессии белков, участвующих в регуляции процессов воспаления (NF-κB), апоптоза (JNK) и метаболизма (PTP1B). Кроме того, у самцов мышей цианидин и дельфинидин улучшали показатели дислипидемии и инсулинорезистентности на диете с высоким содержанием жиров [29]. Дельфинидин и цианидин оказывали цитотоксическое действие на клетки линий колоректального рака LoVo и LoVo/ADR. При этом дельфинидин вызывал незначительное повышение, а цианидин – снижение количества активных форм кислорода (далее – АФК) в клетках [30]. Было показано, что дельфинидин оказывает антипролиферативное действие в отношении различных видов рака (простаты, колоректального рака, рака яичников, кожи, молочной железы, мочевого пузыря, первичной опухоли головного мозга и остеосаркомы) [31].
Перечисленные, а также полученные нами результаты подчеркивают необходимость дальнейших исследований для понимания механизмов, лежащих в основе различных биологических эффектов дельфинидина и выяснения возможностей его потенциального применения в терапии возраст-зависимых заболеваний.
Заключение
Таким образом, в нашем исследовании мы обнаружили достоверный разнонаправленный эффект природного антоциана дельфинидина на медианную продолжительность жизни особей обоих полов Drosophila melanogaster.
Наблюдаемое у самок дрозофил увеличение продолжительности жизни после кормления дельфинидин-3-глюкозидом подчеркивает его потенциал в качестве натуральной добавки для замедления старения. Однако необходимы дальнейшие исследования влияния дельфинидина на связанные со старением параметры жизнеспособности организма, такие как стрессоустойчивость и двигательная активность на модели Drosophila melanogaster. Также необходимо провести анализ изменения экспрессии генов (таких как Sirt1, Keap1, NRF2, Sod1, HIF1,Clk, per), чтобы выяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе наблюдаемых эффектов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
