The aim of the study is to determine the sensitivity of representatives of conditionally pathogenic (causative agents of inflammatory and purulent-septic diseases of soft tissues, skin, mucous organs of digestion and reproduction of cattle in the Kemerovo Region) and normal intestinal microorganisms: S. aureus, E. coli, B. cereus , P. mirabilis, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. to the extract of the roots and rhizomes of the burnet officinalis in various dilutions to establish the minimum inhibitory concentration of the prepared dosage form in the form of a solution. Conditionally pathogenic microorganisms are the main causative agents of inflammatory and purulent-septic diseases of soft tissues, skin, mucous organs of digestion and reproduction of cattle in the Kemerovo Region. The studies were carried out by the cultural method, with the addition of burnet extract, prepared according to the standard method, to nutritious meat-peptone agar. The experiment used solutions of burnet extract added to nutrient agar in the ratio 1:1, 1:2, 1:4, 1:8. Burnet extract in all dilutions inhibited the growth of S. aureus and representatives of normal microflora: Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. E. coli showed insensitivity to the test extract at all dilutions. The growth of B. cereus and P. mirabilis was inhibited by the studied extract at a dilution of 1:1, 1:2, 1:4. At a dilution of 1:8, a good, distinct growth of colonies was observed that is typical of these types of microorganisms. It is effective to use burnet extract in the form of a solution in the treatment of purulent-septic processes of soft tissues and mucous membranes infected with S. aureus, as well as to prevent the development of an infectious process caused by it. The use of burnet extract for the treatment and prevention of infections caused by B. cereus and P. mirabilis may be ineffective due to the low inhibition of the growth of these microorganisms on dense nutrient media. Inhibition of the growth of normal microflora Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. can disrupt the microecological balance of the digestive tract, so oral burnet extract is not recommended. It is necessary to confine to parenteral methods of using various dosage forms, including solutions containing burnet extract.
burnet officinalis, antimicrobial property, extract, beneficial microflora, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus and Proteus mirabilis, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp.
Введение. Кровохлебка является лекарственным растением, которое обладает местным противовоспалительным и сосудосуживающим действиями. Ее применяют при желудочно-кишечных расстройствах, бронхитах, туберкулезах, заболеваниях шейки матки, наружно ее применяют для лечения ран, язв и ушибов. Также она зарекомендовала себя как антисептическое средство в отношении золотистого стафилококка, кишечной палочки, в менее выраженной степени от брюшнотифозной, паратифозной и дизентерийной инфекции. Помимо всего, было установлено, что экстракт кровохлебки губительно влияет на трихомонаду, некоторые бактерии и лямблии.
Своими антибактериальными свойствами кровохлебка обязана содержащимся в ней в большом количестве дубильных веществ – тритерпеноиды, ситостерины, эфирное масло, витамин С, до 30 % крахмала, терпеновые гликозиды. Дубильные вещества кровохлебки проявляют свои свойства до разведения в 32 раза, при дальнейших разведениях наблюдается рост всех микроорганизмов [1, 2].
Доказано, что спиртовые экстракты кровохлебки усиливают способность макрофагов к фагоцитозу и увеличивают секрецию цитокинов воспаления (TNF-α, IFN, IL-8), а также подавляют репликацию вируса и продукцию воспалительных цитокинов, не проявляя токсичности [3, 4].
Водные вытяжки корней и корневищ растения обладают повышенной антимикробной активностью к Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis [3].
Также при исследовании отвара корней и корневищ кровохлебки было установлено, что благодаря большому содержанию дубильных веществ растение обладает бактерицидным действием и успешно может применяться при различных патологиях, вызванных бактериальными агентами, особенно эффективно при дизентериях, вызванных сальмонеллами и шигеллами [5].
Все вышеперечисленные микроорганизмы распространены повсеместно. Но наиболее актуальными для Кемеровской области являются возбудители инфекционных гнойно-септических заболеваний мягких тканей, кожи и слизистых оболочек пищеварительного тракта, органов размножения: представители семейств Enterobacteriacea, Enterococcusceae, Staphylococcuscea, Bacillus spp. [6] (рис. 1, 2).
Рис. 1. Удельный вес микроорганизмов, изолированных от крупного рогатого скота
с клиническими и патологоанатомическими признаками инфекционного заболевания
в Кемеровской области
Рис. 2. Удельный вес микроорганизмов, изолированных от пациентов лечебно-профилактических учреждений Кемеровской области (URL: https://amrmap.ru)
Цель исследования – определение чувствительности представителей условно-патогенных (возбудителей воспалительных и гнойно-септических заболеваний мягких тканей, кожи, слизистых органов пищеварения и размножения крупного рогатого скота в Кемеровской области) и нормальных кишечных микроорганизмов: S. aureus, E. coli, B. cereus, P. mirabilis, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. – к экстракту корней и корневищ кровохлебки лекарственной в различных разведениях для установления минимальной ингибирующей концентрации приготовленной лекарственной формы в виде раствора.
Объекты и методы. Для исследования были использованы фильтр-пакетики с корнями и корневищами (подземными органами) кровохлебки лекарственной.
Отвар из пакетиков получали по инструкции, 3 фильтр-пакетика заваривали в 200 мл кипяченой воды, давали настояться отвару 15 мин, при этом периодически отжимая фильтр-пакетики, затем полученный отвар доводили до 200 мл кипяченной водой.
Производили разведение полученного экстракта физиологическим раствором в концентрации 1:2, 1:4, 1:8. Определение концентрации дубильных веществ, способной ингибировать рост исследуемых культур микроорганизмов, производили в соответствии с ОФС.1.5.3.0008.15 «Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» [7]. Далее готовили плотные питательные среды (мясо-пептонный агар, г. Оболенск (МПА)), в который добавляли отвар кровохлебки, разведенный физиологическим раствором, соответственно: в соотношении 1:2 (5 / 10 мл, содержание дубильных веществ 5,74 ± 0,36 %), 1:4 (2,5 / 7,5 мл, содержание дубильных веществ 3,28 ± 0,48 %) и 1:8 (1,25 / 8,75 мл, содержание дубильных веществ 1,36 ± 0,57 %). Еще одна проба была приготовлена с натуральным разведением 10 / 20 мл питательного агара с содержанием дубильных веществ 7,13 ± 0,24 %. Ставили положительный контроль: мясо-пептонный агар без добавления экстракта (табл. 1).
Таблица 1
Схема опыта in vitro по определению антимикробных свойств экстракта кровохлебки
в отношении условно-патогенных микроорганизмов
|
Разведение экстракта кровохлебки в МПА, содержание дубильных веществ |
|
|
Staphylococcus aureus |
1:2 (5 / 10 мл), 5,74 ± 0,36 % 1:4 (2,5 / 7,5 мл), 3,28 ± 0,48 % 1:8 (1,25 / 8,75 мл), 1,36 ± 0,57 % Натур. (10 / 20 мл), 7,13 ± 0,24 % |
|
Escherichia coli |
|
|
Bacillus cereus |
|
|
Proteus mirabilis |
Тестируемые штаммы микроорганизмов изолировали из биологического материала от крупного рогатого скота с гнойно-катаральными эндометритами. Отбор проб производили в соответствии с МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории: методические указания» [8]. Определение видовой принадлежности штаммов микроорганизмов осуществлялось в соответствии с «Методическими указаниями по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями», утв. Минздравом 17.12.1984 [9]; Методическими рекомендациями «Метициллинрезистентные Staphyloco-ccus aureus – возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование», утв. Роспотребнадзором 23.07.2006 [10]; Методическими рекомендациями «Выделение и идентификация бактерий желудочно-кишечного тракта животных», утв. Минсельхозом 11.05. 2004 [11]. Для определения антимикробной активности отвара корневищ и корней кровохлебки лекарственной использовали метод диффузии в агар (способ «колодцев») [12]. Определение проводили по отношению к пяти 24-часовым тест-культурам (S. aureus, E. coli, B. cereus, P. mirabilis, Lactobacillus spp., Bifido-bacterium spp.). Микробную взвесь, содержащую 500 млн микробных тел в 1 мл, вносили в лунки по 0,1 мл. Критерии полученных результатов: отсутствие зоны задержки роста – испытуемая культура не чувствительна к данной концентрации испытуемого образца; диаметр зоны задержки 10 мм – умеренная чувствительность; более 10 мм – высокая чувствительность.
Данные были получены методом количественного анализа, обработаны статистически (табл. 2).
Результаты и их обсуждение. Была исследована способность отвара корней и корневищ кровохлебки ингибировать рост условно-патогенной (S. aureus, E. coli, B. cereus, P. Mirabilis) и нормальной микрофлоры тела животных и человека (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp.). Негативное влияние на организм животных и человека условно-патогенных микроорганизмов с измененными свойствами (патогенными, токсигенными) или попавшими в несвойственные им биотопы не вызывает сомнения у лечащих врачей. Поэтому совершенствование методов борьбы с ними является одной из стратегий развития терапевтических приемов. В то же время, применяя химиотерапевтические и другие фармацевтические препараты, нужно учитывать сохранение представителей нормофлоры. Выживаемость молочнокислых микроорганизмов является принципиальным фактором при лечебно-профилактических мероприятиях, так как нарушение микроэкологии слизистых оболочек и кожи животных и человека опосредует развитие прогнозируемых и неожиданных последствий для организма.
В связи с этим, исследуя антимикробную активность некоторых действующих веществ или экстрактов растений, необходимо изучить их влияние не только на возбудителей заболеваний, но также и на нормальных представителей биоценозов организма животных и человека.
По результатам исследования установлено, что при разведении 1:2 (5 /10 мл), с содержанием дубильных веществ 5,74 ± 0,36 %, высокая чувствительность с зоной задержки роста в 13 мм установлена у Staphylococcus aureus, а также нормальной микрофлоры Lactobacillus spp. – 14 мм и Вifidumbacteria spp. – 12 мм. Присутствует рост Escherichia coli без зоны задержки роста и умеренная чувствительность Bacillus cereus – 6 мм, Proteus mirabilis – 8 мм.
В разведении 1:4 (2,5 / 7,5 мл), с содержанием дубильных веществ 3,28 ± 0,48 %, зона задержки роста Staphylococcus aureus составляет 12 мм, умеренная чувствительность наблюдается у Bacillus cereus – 3 мм и Proteus mirabilis – 5 мм; отсутствие зоны задержки роста наблюдается у Escherichia coli.
При разведении 1:8 (1,25 / 8,75 мл), с содержанием дубильных веществ 1,36 ± 0,57 %, наблюдается умеренная задержка роста Staphylococcus aureus – 5 мм, отсутствие зоны задержки роста у Escherichia coli, Bacillus cereus и Proteus mirabilis.
В натуральном разведении (10 / 20 мл), с содержанием дубильных веществ 7,13 ± 0,24 %, у Staphylococcus aureus установлена высокая чувствительность – 17 мм, Escherichia coli – отсутствие зоны задержки роста; умеренная задержка роста у Bacillus cereus – 8 мм, Proteus mirabilis – 10 мм (табл. 2).
Таблица 2
Определение чувствительности условно-патогенных микроорганизмов
в отношении экстракта кровохлебки, мм
|
Разведение экстракта кровохлебки, содержание дубильных веществ |
Staphylococcus aureus |
Escherichia coli |
Bacillus cereus |
Proteus mirabilis |
Lactobacillus spp |
Вifidum bacteria spp. |
|
1:2 (5 /10 мл), 5,74 ± 0,36 %х |
13 |
0 |
6 |
8 |
14 |
12 |
|
1:4 (2,5 / 7,5 мл), 3,28 ± 0,48 %0 |
12 |
0 |
3 |
5 |
13 |
12 |
|
1:8 (1,25 / 8,75 мл), 1,36 ± 0,57 %х |
5 |
0 |
0 |
0 |
10 |
9 |
|
Натур. (10 / 20 мл), 7,13 ± 0,24 %х |
17 |
0 |
8 |
10 |
15 |
15 |
Примечание: х – изменения достоверны относительно контроля (р < 0,05); 0 – изменения недостоверны относительно контроля (р > 0,05); % – в пересчете на танин в абсолютно сухом сырье.
В соответствии с полученными данными установлено, что к экстракту кровохлебки наиболее чувствителен S. aureus, в связи с чем целесообразно применять различные лекарственные формы, содержащие экстракт кровохлебки, при инфекционных заболеваниях, вызванных этим микроорганизмом. В связи нечувствительностью и низкой чувствительностью E. coli, B. cereus, P. mirabilis к экстракту кровохлебки применение лекарственных форм, содержащих экстракт кровохлебки, при заболеваниях, вызванных данными микроорганизмами, может иметь низкую лечебную эффективность.
Ингибирование роста отваром кровохлебки установлено также в отношении молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. В связи с этим существует риск развития дисбиотических нарушений на слизистых оболочках, с последующими негативными проявлениями этого состояния на микроэкологию биотопов животных и человека. Поэтому применение экстракта кровохлебки должно быть контролируемым и дозируемым.
Заключение
- Кровохлебка лекарственная обладает антимикробными свойствами. При натуральном разведении, в разведении 1:2 и 1:4 мы видим, что кровохлебка подавляет рост Staphylococcus aureus, Bacillus cereus и Proteus mirabilis.
- Стойкий и активный рост при всех разведениях наблюдается у Escherichia coli, что говорит о нечувствительности этого микроорганизма к действующим антибактериальным веществам, содержащихся в кровохлебке.
- Самая высокая антимикробная активность экстракта кровохлебки наблюдается в отношении к Staphylococcus aureus. Наиболее оптимально применять лекарственные формы, содержащие экстракт кровохлебки, при лечении и профилактике гнойно-септических заболеваниях, вызванных Staphylococcus aureus.
- Экстракт кровохлебки влияет на представителей нормальной микрофлоры, она подавляет рост Lactobacillus spp. и Вifidumbacteria spp. В соответствии с этим применение лекарственных форм, содержащих экстракты кровохлебки, per os нежелательно. Рекомендуемый прием препаратов, содержащих экстракт кровохлебки, – парентеральный.
1. Selezneva E.S., Papayani O.I., Popov I.V. Izuchenie antimikrobnoy aktivnosti izvlecheniy travy i podzemnyh organov Sangusorba minor L. // Razrabotka, issledovanie i marketing novoy farmacevticheskoy produkcii: sb. nauch. tr. Vyp. 73. Pyatigorsk, 2018. S. 123–127.
2. Antimikrobnaya aktivnost' vodnyh izvlecheniy iz podzemnyh organov nekotoryh vidov lapchatki / D.M. Hisyamova [i dr.] // Farmaciya. 2016. № 1. S. 32–34.
3. Kazeeva A.R., Pupykina K.A. Izuchenie soderzhaniya osnovnoy gruppy biologicheski aktivnyh veschestv v krovohlebke lekarstvennoy v raznye fazy vegetacii rasteniya // Tradicionnaya medicina. 2015. № 2 (41). 2015. S. 37–38.
4. Muhametgaliev N.R., Idrisova G.I., Gilazieva G.Z. Sravnitel'nyy analiz soderzhaniya dubil'nyh veschestv v kornevischah krovohlebki lekarstvennoy (Sanguisorba officinalis L.) // Uchenye zapiski Kazanskogo universiteta. Ser. Estestvennye nauki. 2015. T. 157, № 2. S. 58–68.
5. Saparklycheva S.E., Chapalda T.L. Antimikrobnaya aktivnost' krovohlebki lekarstvennoy // Agrarnoe obrazovanie i nauka UGAU. Ser. «Biologicheskie nauki». Ekaterinburg, 2020. S. 10.
6. Evstratenko A.L. Mikrobiom verhnih dyhatel'nyh putey u telyat v norme i patologii // Kuzbass: obrazovanie, nauka, innovacii. Molodezhnyy vklad v razvitie nauchno-obrazovatel'nogo centra «Kuzbass»: mat-ly X Innovacionnogo konventa (Kemerovo, 30 yanvarya 2022 g.). Kemerovo: Kemerov. gos. un-t, 2022. S. 283–286.
7. OFS.1.5.3.0008.15. Opredelenie soderzhaniya dubil'nyh veschestv v lekarstvennom rastitel'nom syr'e i lekarstvennyh rastitel'nyh preparatah. URL: http://pharmacopoeia (data obrascheniya: 20.01.2023).
8. MU 4.2.2039-05. Metody kontrolya. Biologicheskie i mikrobiologicheskie faktory. Tehnika sbora i transportirovaniya biomaterialov v mikrobiologicheskie laboratorii: metod. ukazaniya (utv. Rospotrebnadzorom, 23.12.2005). URL: https://goo.su/kftu8 (data obrascheniya: 20.01.2023).
9. Metodicheskie ukazaniya po mikrobiologicheskoy diagnostike zabolevaniy, vyzyvaemyh enterobakteriyam (utv. Minzdravom 17.12.1984). URL: https://goo.su/9AZvx (data obrascheniya: 22.01.2023).
10. Meticillinrezistentnye Staphylococcus aureus – vozbuditeli vnutribol'nichnyh infekciy: identifikaciya i genotipirovanie: metod. rekomendacii (utv. Rospotrebnadzorom 23.07.2006). URL: https://goo.su/ gtl1 (data obrascheniya: 15.02.2023).
11. Vydelenie i identifikaciya bakteriy zheludochno-kishechnogo trakta zhivotnyh: metod. rekomendacii (utv. Minsel'hozom 11.05.2004). URL: https://goo.su/1FPIxh (data obrascheniya: 15.02.2023).
12. Gunar O.V., Kamatova N.I., Evtushenko N.S. Opredelenie antimikrobnogo deystviya lekarstvennyh veschestv. Prakticheskie podhody // Farmaciya. 2002. № 2. S. 4–7.
