Введение. Рентабельность отрасли животноводства определяется уровнем воспроизводства поголовья и количеством произведенной продукции. В частности, использование высокоценных производителей, обладающих хорошим генетическим потенциалом по качественным и количественным показателям, будет способствовать созданию конкурентоспособной отрасли и решению вопросов импортозамещения.
В условиях интенсивного развития отрасли репродуктивная система производителей постоянно подвергается влиянию различных факторов биотической и абиотической природы, которые приводят к снижению фертильности или идиопатическому бесплодию [1–4].
Одной из причин развития идиопатического бесплодия могут являться иммуногенные дефекты, генетические нарушения, воспаления и инфекционные проблемы [5]. Воспаление прямо или косвенно ухудшает сперматогенез и функцию сперматозоидов за счет выработки антител сперматозоидов и активных форм кислорода (АФК), которые приводят к нарушению целостности ДНК [6]. Контаминация патогенными бактериями репродуктивных путей самцов представляет большую угрозу маточному поголовью и является причиной их бесплодия. Так, у крупного рогатого скота болезни органов размножения производителей [7] или использование некачественной спермы [8] способствуют возникновению у коров длительного бесплодия.
Более остро проблема заготовки и хранения качественного семени стоит в индустрии искусственного осеменения, так как риск распространения инфекционных заболеваний через контаминацию половых путей самок от производителей-бактерионосителей остается потенциально высоким [9].
Обсеменение спермы микробными ассоциациями и грибами чаще всего происходит во время забора спермы у животного (нарушение волосяного покрова, гиперемия препуциальной полости, травмы), из-за неудовлетворительных санитарно-гигиенических условий в помещении (загрязнение воздуха в случном манеже) [10, 11], во время фасовки и хранения спермы, при нарушении порядка и режима в лаборатории (грязная лабораторная посуда, инструменты, разбавители, небрежная эквилибрация), а также от производителей-бактерионосителей [12].
По данным С.П. Яцентюк с соавт., в спермодозе от быков из отечественных племенных центров и спермы, разделенной по полу, были выявлены: вирус герпеса (BovineHerpesvirus 1, BHV1) – 1,94 %; Campylobacter Spp – 84,4; Histophilussomni – 90,2; C. jejuni – 18,4; Mycoplasma spp – 91,2 %. Наличие Mycoplasma spp. в репродуктивном тракте здоровых животных оказывает негативное влияние на репродуктивные качества семени [13]. По данным [14], в пробах семени быков спермодоноров из российских племенных хозяйств у 23,6 % обнаружили геном возбудителей микоплазмозов КРС, и наиболее чаще выявляли геном M. Bovigenitalium. На территории Уральского региона у крупного рогатого скота было выявлено коинфицирование M. bovis и M. bovigenitalium в 17,2 % пробах [15].
Способность микоплазм (Mycoplasma spp.) контаминировать сперму быков-производителей отмечается в работах российских и зарубежных авторов [16–18]. Микоплазмы изменяют концентрацию, подвижность [19] и морфологию [20] сперматозоидов. Более того, отмечается фрагментация ДНК сперматозоидов относительно неинфицированных производителей [21, 22]. Также было показано, что при выявлении M. bovigenitalium в образцах спермы быков подвижность сперматозоидов снижается [23].
Проведенные исследования показывают, что наличие в сперме микоплазмы (Mycoplasma spp.) оказывает влияние на параметры спермопродукции и фрагментацию ДНК сперматозоидов, что приводит к снижению фертильности производителей, однако вопрос остается спорным и требует дальнейшего изучения.
Цель исследования – изучение влияния бактериальной контаминации спермы быков на биологическую полноценность сперматозоидов и показатели воспроизводства.
Задачи: провести микробиологические исследования замороженно-оттаянной спермы быков-производителей; определить активность сперматозоидов в исследуемых пробах спермодоз; изучить степень фрагментации ядерной ДНК в сперматозоидах; определить влияние микробной контаминации спермопродукции на воспроизводительные показатели стада.
Объекты, материалы и методы. Исследование проводили в лаборатории клеточной инженерии ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста».
Объектом исследования были быки-производители голштинской черно-пестрой породы (n = 17). Материалом для исследования служила замороженно-оттаянная сперма быков-производителей в количестве 61 пробы. Микробиологические исследования спермодоз проводили с использованием стандартных питательных сред в соответствии с ГОСТ 32222-2013 [24]. Посевы инкубировали. Определение общего количества микроорганизмов вычисляли по числу выросших колонобразующих единиц (КОЕ/мл) в 1 см3, с последующим определением их морфологических свойств. Подвижность и морфологию сперматозоидов определяли с помощью программы «Аргус CASA». Состояние ДНК в сперматозоидах изучали методом акридин-оранжевого теста (АО-тест) с применением флуоресцентного микроскопа, оснащенного кубом флуоресцентных фильтров GFP-LEX460-500 DM 505BA510 с окуляром 15х и объективом 20х, 40х, 100x [25].
Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью пакета программ MS Excel и SPSS Statistics 23.
Результаты и их обсуждение. Активность сперматозоидов является одним из важнейших показателей, характеризующих качество спермы. Содержание сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением в среднем составило 46,2 % (от min = 19,1 % до max = 69,2 %). Наименьшая подвижность была отмечена у быков №1 (25,4 %), № 13 (19,1 %) и № 17 (29 %), у остальных производителей активность составила от 41 до 69,2 %, что соответствует нормативным величинам.
Общее количество сперматозоидов с патологической морфологией колебалось от 8,3 до 19,4 %, среди патологических дефектов преобладали аномалии жгутика. Корреляционный анализ показывает высокую положительную взаимосвязь (r = +0,940**) между количеством микроорганизмов в сперме и патологией в строении отдельных сегментов сперматозоидов (табл. 1).
Таблица 1
Корреляционная взаимосвязь между показателями
|
Показатель |
Анормальные сперматозоиды, % |
Индекс фрагментации |
Кол-во бактерий, КОЕ/мл |
Активность сперматозоидов, % |
|
Анормальные сперматозоиды, % |
1 |
+0,940** |
+0,944** |
–0,798** |
|
Индекс фрагментации |
+0,940** |
1 |
+0,965** |
–0,761** |
|
Количество бактерий, КОЕ/мл |
+0,944** |
+0,965** |
1 |
–0,768** |
|
Активность спермтозоидов,% |
–0,798** |
–0,761** |
–0,768** |
1 |
** Уровень значимости корреляции 0,01.
Установлена высокая отрицательная корреляционная взаимосвязь между количеством бактерий в сперме с активностью сперматозоидов (r = –0,768**).
Подтверждаются научные данные о влиянии высокой контаминации микроорганизмов на морфологию сперматозоидов. Дисперсионный анализ показал статистически значимое влияние количества микроорганизмов на морфологию сперматозоидов F = 123,2 (p = 0,000). Нужно отметить, что у производителей № 1, № 13, № 17 число сперматозоидов с аномальной морфологией было выше стандартных показателей (19,2 %; 19,4; 18,5 % соответственно) (рис. 1).
Рис. 1. Показатели аномалий морфометрии и индекса фрагментации ДНК сперматозоидов
у быков-производителей
Анализ состояния хроматина с помощью акридин-оранжевого теста (АО-тест) показал более высокую степень фрагментации ДНК (DFI) у быков-производителей № 1 (58,2 %), № 13 (61,3 %) и № 17 (54,3 %), чем средние показатели по исследуемой выборке. Можно отметить, что в образцах трех быков (№ 1, № 13, № 17) отмечается низкая подвижность, выше частота дефектов морфологии и выше индекс фрагментации ДНК. Корреляционная взаимосвязь между индексом фрагментации и содержанием микроорганизм высокая (r = +0,965**).
Общее количество микроорганизмов (КОЕ/см3) во всех исследуемых образцах соответствовало стандартным показателям ГОСТ 26030–2015 «Средства воспроизводства. Сперма быков замороженная», за исключением трех образцов, где общее количество микроорганизмов было на погранично-допустимом уровне: № 1 (КОЕ/см3 450), № 13 (КОЕ/см3 510), и № 17 (КОЕ/см3 480) (рис. 2).
В образцах быков № 1, № 13 и № 17 была выявлена микоплазма (Mycoplasma spp). Подвижность сперматозоидов в образцах с содержанием Mycoplasma spp. в среднем составляет 24,5 %, в образцах без содержания – 48,9 %.
Как показывают результаты исследования, наличие микоплазмы в образцах № 1, № 13 и № 17 оказало большее влияние на подвижность, морфометрические показатели и целостность ДНК.
Рис. 2. Общее количество микроорганизмов в эякуляте у быков-производителей
Репродуктивные показатели быков-производителей с выявленной микоплазмой были значительно хуже.
Результаты регрессионного анализа показывают тесную взаимосвязь стельности коров от первого осеменения с содержанием бактерий в сперме (табл. 2). В среднем по выборке стельность от первого осеменения составила 48,08 %. У трех быков (№ 1, №13, № 17) с выявленной микоплазмой количество коров с плодотворным осеменением было наименьшим и составило 33,1 %; 36,6 и 36,9 % соответственно.
Таблица 2
Дисперсионный анализ взаимосвязи стельности коров от первого осеменения*
с количеством бактерии в сперме
|
Модель |
Сумма квадратов |
ст.св. |
Средний квадрат |
F |
Значимость |
|
|
1 |
Регрессия |
686,223 |
1 |
686,223 |
14,868 |
0,001** |
|
Остаток |
738,475 |
16 |
46,155 |
|
|
|
|
Всего |
1424,698 |
17 |
|
|
|
|
*Зависимая переменная: стельность коров от первого осеменения, %.
**Предикторы: (константа), Количество бактерий, КОЕ/мл.
Заключение. Таким образом, результаты исследования показали, что в образцах спермы с содержанием бактерии 450–510 КОЕ/мл наблюдается увеличение индекса фрагментации ДНК до 61,3 %. В 17,6 % исследуемых образцов были обнаружены Mycoplasma spp., в них доля сперматозоидов с аномальной морфологией составляет 19 %, что больше на 9 %, чем в образцах, в которых не обнаружены Mycoplasma spp., и содержанием бактерий в среднем 185,71КОЕ/мл. Подвижность сперматозоидов в образцах с содержанием Mycoplasma spp. в среднем составляет 24,5 %, в образцах без содержания – 48,9 %. Следовательно, можно предположить, что наличие в образцах Mycoplasma spp. и высокие показатели бактериальной обсемененности приводят к снижению показателей воспроизводства у производителей.
