Введение
Производные графена широко используются в различных областях, включая накопление энергии, наноэлектронные устройства и батареи, биомедицинские приложения, биосенсоры, визуализацию клеток, доставку лекарств и тканевую инженерию [1-3]. Графеноподобные материалы могут служить «строительной платформой» для конструирования различных супрамолекулярных продуктов, которые имеют целый ряд потенциальных практических применений [4].
Оксид графена представляет собой соединение углерода, кислорода и водорода в различных соотношениях, полученное обработкой графита сильными окислителями. Обилие гидрофильных кислородосодержащих групп на поверхности делает его хорошо диспергируемым в полярных растворителях, в частности, в воде [5]. Это делает данный материал очень перспективным для медицинских и биотехнологических приложений, т.к., с одной стороны, гидрофильность чешуек оксида графена повышает его биодоступность, а с другой, наличие многочисленных =O, –OH и –COOH групп на поверхности облегчает функционализацию наноматериала биоактивными молекулами (антибиотиками, нуклеиновыми кислотами и т.д.).
Перспективным является использование оксида графена в сельском хозяйстве и биотехнологиях для стимуляции роста и защиты растений [6-8].
В то же время имеются работы, показывающие токсическое действие оксида графена по отношению к растениям. Так Рен с соавторами показали ингибирующее действие наноматериала в концентрации 500 мг/л на проростки кукурузы, сопровождаемое изменением концентрации Ca2+, продукцией АФК и перекисным окислением липидов [9]. При сравнении эффектов оксида графена и графена, модифицированного амином (G-NH2), было обнаружено, что в высоких концентрациях (500, 1000 и 2000 мг/л) оксид графена ингибировал процесс прорастания пшеницы и рост проростков, в то время как такие же дозы G-NH2 оказывали положительное воздействие. Под воздействием оксида графена увеличивалась потеря электролитов корнями, что свидетельствует о фитотоксичности этого типа наноматериала в высоких дозировках [10]. По данным Вочиты и коллег [11], прорастание семян пшеницы подавлялось высокой дозой оксида графена (2000 мг/л), и при этой концентрации также наблюдалось небольшое угнетение удлинения корня. Помимо этого, увеличение числа хромосомных аберраций и митотических аномалий указывает на генотоксические эффекты оксида графена в корневой меристеме пшеницы.
Несмотря на наличие работ по оценке влияния оксида графена на сельскохозяйственные растения, исследований, показывающих воздействие оксида графена на древесные культуры, играющие важную роль в наземных экосистемах, в открытом доступе не представлено, что обусловливает актуальность настоящего исследования. В представляемой работе показаны результаты исследования по оценке влияния оксида графена на проростки березы пушистой на этапе адаптации к нестерильным условиям теплицы.
Береза является популярным объектом для культивирования, т.к. находит широкое применение в лесовосстановлении и озеленении [12,13].
Материалы и методы
Получение и исследование наноматериала. Наночастицы оксида графена (GO) были получены методом Хаммерса [14], путем химической эксфолиации графита. Исследование наноматериала проводили с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния на Рамановском микроскопе Thermo DXR (Thermo Scientific, США) с лазером 532 нм при мощности 1 мВт через объектив 100х, сканирующей электронной микроскопии на микроскопе Vega3, Tescan (Чешская Республика) и атомно-силовой микроскопии на приборе AIST-NT (AIST-NT, Россия) в полуконтактном режиме с насадками NTMDT AFM.
Биологическое исследование. В работе использовались регенеранты березы пушистой, полученные путем клонального микроразмножения на этапе их адаптации к условиям теплицы. На этапах введения в культуру, мультипликации и укоренения использовали питательные среды, также содержащие оксид графена в различных концентрациях. Установлено негативное влияние наноматериала на проростки в дозе более 3 мкг/л, в то же время при 1,5 мкг/л отмечены положительные эффекты [15,16]. В связи с чем, на этапе адаптации растений были использованы концентрации наноматериала 1,5 и 3 мкг/л. В эксперименте использовали выровненные растения, имеющие 4-5 листьев и корневую систему длиной не менее 2 см. Проростки высаживали в технологические кассеты (объем ячейки - 155 мл.) наполненные увлажненным почвенным субстратом. Субстрат состоял из нейтрального торфа и перлита в соотношении 3:1. Растения культивировались в условиях парника в течение трёх недель при температуре 20-24 °С, 15-ти часовом фотопериоде, освещённости 4500 Люкс, относительной влажности воздуха 80-90 %. Для создания условий повышенной влажности в парнике применялась туманообразующая установка. Обработку проводили водными растворами оксида графена, полученными разведением исходной суспензии наноматериала дистиллирорванной водой до нужных концентраций. Обработку проводили в момент высадки и спустя 1,5 недели, путем введения препаратов под корень (100 мл раствора на ячейку). В качестве контролей использовались дистиллированная вода и ростовой стимулятор 2,4-эпибрассинолид, выпускаемый под коммерческим названием «Эпин» (Россия). В ходе исследования проводили учет следующих показателей: количество выживших растений, количество растений адаптированных к нестерильным условиям, морфометрические параметры побегов (высота растений, число листьев, число увядших листьев, количество дополнительных побегов, состояние по пятибалльной шкале).
Эксперимент проводился в 3-ёх кратной повторности, количество растений в каждой из 4-ёх групп («Контроль», «Эпин», «GO 1 мкг/л» и «GO 3 мкг/л») составляло 30, выборки имели независимый характер. Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием программы Microsoft Excel 2010 (пакет «Описательная статистика») с применением однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), достоверность различий вычислялась с помощью F-критерия Фишера при 5%-ном уровне значимости.
Анализ накопления оксида графена в растениях. Анализ нанкопления и распределения оксида графена в тканях экспериментальных растений осуществлялся на сканирующих электронных микроскопах Neon 40 и Merlin (Carl Zeiss, Германия) с элементным анализом. Для проведения исследования навеску растительной ткани массой 250 мг растирали в охлажденной ступке в 0,5 мл дистиллированной воды. Полученный гомогенат наносили на подложку и высушивали при комнатной температуре.
Результаты и обсуждение
Результаты анализа образца оксида графена. Исследование методом рамановской спектроскопии подтвердило принадлежность полученного материала к оксиду графена – были зафиксированы основные линии характерные для данного наноматериала D (1338 см-1) и G (1590 см-1) [17-19]. Методом сканирующей электронной микроскопии установлено, что образец имеет пластинчатую структуру без каких-либо других видов частиц кристаллизованной фазы. Анализ образца методом атомно-силовой микроскопии показал, что поперечный размер чешуек варьируется от 0,1 до 3 мкм, в то время как их средняя толщина менее 1 нм. Таким образом, анализ полученного образца оксида графена показал, что материал имеет характерную пластинчатую морфологию с размером отдельных чешуек от 0,1 до 3 мкм и толщиной менее 1 нм.
Влияние оксида графена на проростки березы пушистой. Результаты исследования влияния оксида графена на проростки березы пушистой показали, что оксид графена в концентрации 1,5 мкг/л не оказал достоверного влияния на выживаемость растений, однако при повышении концентрации до 3 мкг/л показатель уменьшался до 10% относительно контроля (Рис. 1). Максимальный показатель выживаемости наблюдался при обработке растений стимулятором роста - +5%.
Максимальная высота растений наблюдалась в группе обработанной Эпином – 4,4 см, против 4 см в контроле. При 1,5 мкг/л оксида графена значения высоты побегов были на уровне контрольных, а при 3 мгк/л показатель уменьшился на 25% и составил в среднем 3 см (Рис. 2).
Внесение оксида графена в концентрации 1,5 мкг/л благоприятно сказалось на развитии листьев. В этом варианте увеличилось среднее количество листьев на одном растении (+1), а также изменилось соотношение нормальных листьев к увядшим (Рис. 3). На 6 развившихся листьев отмечалось 3 увядших, в то время как в контроле из 5 листьев увядало 4. Худшие показатели зафиксированы в варианте 3 мкг/л оксида графена – на 4 листа, 4 увядших.
Рисунок 1. Влияние оксида графена на выживаемость регенерантов березы пушистой
Figure 1. Effect of graphene oxide on the survival rate of downy birch regenerated
Источник: собственные вычисления автор(ов)
Source: own calculations
Рисунок 2. Влияние оксида графена на рост регенерантов березы пушистой
Figure 2. Effect of graphene oxide on the growth of downy birch regenerants
Источник: собственные вычисления автор(ов)
Source: own calculations
При оценке адапрированности растений к нестерильным условиям также установлено положительное влияние оксида графена в дозе 1,5 мкг/л. Число адаптированных растений составило 60% (на уровне регулятора роста) при 52% в контрольном варианте (Рис. 4). При повышении концентрации наноматериала число адаптированных растений снизилось на 35%.
Рисунок 3. Состояние вегетативных органов регенерантов березы пушистой
Figure 3. The state of the vegetative organs of the downy birch regenerated
Источник: собственные вычисления автор(ов)
Source: own calculations
Рисунок 4. Эффективность адаптации регенерантов березы пушистой
Figure 4. The efficiency of adaptation of downy birch regenerated
Источник: собственные вычисления автор(ов)
Source: own calculations
Наилучшее состояние растений было в группе, культивируемой с применением стимулятора, худшее состояние отмечено в варианте 3 мкг/л оксида графена. (Табл. 1). Дополнительных побегов не образовалось ни в одном из вариантов.
Таблица 1
Показатели эффективности адаптации побегов березы пушистой
Table 1
Indicators of adaptation efficiency of downy birch shoots
|
Вариант | Varaint |
Число дополнительных побегов, шт. Number of extra shoots, pcs. |
Состояние микроклонов по 5-ти бальной шкале | Condition of microclones on a 5-point scale |
|
Контроль | Control |
0 |
4 |
|
Эпин | Epin |
0 |
5 |
|
GO 1,5 мкг/л | GO 1.5 μg/L |
0 |
4 |
|
GO 3 мкг/л | GO 3 μg/L |
0 |
3 |
Источник: собственные вычисления автор(ов)
Source: own calculations
Таким образом, в ходе эксперимента показано, что раствор оксида графена с концентрацией 1,5 мкг/л оказывал благоприятное влияние на появление листьев и на адаптируемость растений (+8%). Однако при повышении концентрации наноматериала до 3 мкг/л выживаемость снизилась на 10% относительно контроля, высота растений на 25%, а число адаптированных растений на 35%. Кроме того, общее состояние проростков данной группы оценивалось только на 3 балла. Разнонаправленное действие оксида графена показано и другими авторами. Например, Наир и др. [20] показали, что проростки риса, проросшие в присутствии графена, показали лучшую жизнеспособность и рост по сравнению с необработанными проростками. Точно так же всхожесть семян томатов увеличивалась порошкообразным графеном, возможно, из-за способности графена улучшать поглощение воды через кожуру семян [21]. С другой стороны, в нескольких исследованиях сообщалось, что прорастание семян задерживалось или подавлялось нанесением графена или оксида графена [22]. В другом краткосрочном исследовании графен способствовал значительному удлинению корня, но ингибировал развитие корневых волосков, что может быть связано с индуцированным графеном окислительным стрессом в корнях проростков пшеницы [23].
Анализ накопления оксида графена в растениях. Для электронно-микроскопического исследования были взяты растения, обработанные раствором оксида графена в концентрации 3 мкг/л, а также растения контрольной группы.
Анализ накопления частиц оксида графена в корнях растений березы не выявил частиц наноматериала (Рис. 5).
Рисунок 5. Микрофотографии корня березы: а) контроль, б) группа 3 мкг/л
Figure 5. Micrographs of the birch root: a) control, b) group 3 μg/L
Источник: собственное исследование автор(ов)
Source: author’s study
Электронно-микроскопическое исследование накопления оксида графена в стеблях березы также показало отсутствие наночастиц (Рис. 6).
Для подтверждения результатов электронно-микроскопического исследования бионакопления и более детального анализа содержания углерода в тканях растений было проведено картирование элемента (Рис. 7).
Рисунок 6. Микрофотографии стебля березы пушистой: а) контроль, б) группа 3 мкг/л
Figure 6. Micrographs of the birch stem: a) control, b) group 3 μ/L
Источник: собственное исследование автор(ов)
Source: author’s study
Рисунок 7. Распределение углерода в тканях корня и стебля березы пушистой: а) корень растений контрольной группы в) стебель растений контрольной группы, б) корень растений группы 3 мкг/л, г) стебель растений группы 3 мкг/л
Figure 7. Distribution of carbon in the tissues of the downy birch root and stem: a) the root of the plants in the control group, c) the stem of the plants in the control group, b) the root of the plants in the 3 μg/L group, d) the stem of the plants in the 3 μg/L group
Источник: собственное исследование автор(ов)
Source: author’s study
Как видно из представленных микрофотографий, во всех случаях углерод характеризовался равномерным распределением по образцу, независимо от обработки растений оксидом графена.
Таким образом, наше исследование показало отсутствие биоаккумуляции оксида графена в побегах березы пушистой. Стоит сказать, что другими авторами показано проникновение наноматериала в растения, например, в проростки гороха [24,25] или шелуху семян томата [21]. Можно предположить, что отмеченные различия связаны с разным размером чешуек и используемыми концентрациями оксида графена, а также с видовыми особенностями растений.
Выводы (Заключение)
Таким образом, в ходе эксперимента установлено разнонаправленное действие оксида графена на регенеранты березы пушистой. При обработке побегов раствором наноматериала с концентрацией 1,5 мкг/л отмечено благоприятное влияние на развитие листьев и адаптируемость растений. В то же время при повышении концентрации вещества до 3 мкг/л снижалась выживаемость и высота побегов, а также число адапрированных растений. С учетом того, что методом электронной микроскопии не зафиксировано бионакопления наночастиц можно говорить, что отмеченные эффекты не связаны с проникновением наноматериала в ткани растений. Например, группа ученых [26] установила, что графеновые квантовые точки (GQD) могут способствовать поглощению воды и питательных веществ за счет увеличения эффективных площадей поверхности эпидермальных (ризодермальных) клеток корня. Разработанная ими схематическая модель показывает, что GQD непосредственно прикрепляются к поверхности клеток корня растений, увеличивая область поглощения ионов на поверхности корня.
Среди возможных механизмов токсического действия оксида графена, не связанных с его проникновение в ткани растений, можно выделить непрямое воздействие через изменение окружающей среды – например, доступности корневого питания или состава микробиоты в прикорневой зоне.
Проведенное исследование, а также результаты работ других авторов свидетельствуют о том, что механизмы воздействия оксида графена на растения требуют дальнейшего изучения. Результаты нашей работы могут быть использованы в биотехнологии клонального микроразмножения растений при переведении их из стерильный лабораторных условий в грунт
