Сокращения: АФК ― активные формы кислорода, в/в ― внутривенно, ДНК ― дезоксирибонуклеиновая кислота, МТ ― масса тела, п/к ― подкожно, ПЦР ― полимеразно-цепная реакция, ABCD ― European Advisory Board on Cat Diseases (Европейский консультативный совет по болезням кошек), GlcNAc ― N-Acetylglucosamine (N-ацетилглюкозамин), ELISA ― enzyme-linked immunosorbent assay (иммуноферментный анализ), FHV ― feline herpesvirus (герпесвирус кошек), Hb ― hemoglobin (гемоглобин), MMR ― macrophage mannose receptor (макрофагальный рецептор маннозы), PRR ― pattern recognition receptor (рецепторы распознавания образов), VNA ― virus-neutralizing antibodies (вирус-нейтрализующие антитела)
Введение
Герпесвирусная инфекция кошек (более известное название ― инфекционный ринотрахеит кошек) ― остропротекающая болезнь, характеризующаяся поражением глаз и органов дыхания. Болеют кошки всех пород, независимо от возраста. Заболеваемость может достигать 50 %, смертность составляет 5…20 %.
Возбудитель (FHV) относится к отряду Herpesvirales, семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Varicellovirus. Вирус инактивируется в течение 3 ч при 37 °С и чувствителен к большинству дезинфицирующих, моющих средств и антисептиков. Остается вирулентным в течение примерно 5 месяцев при 4 °C, около 1 месяца при 25 °C; инактивируется при 56 °C через 4…5 минут [22].
Двухцепочечная ДНК вируса упакована в икосаэдрический капсид, окруженный липидной бислойной оболочкой, из которой выступают шипы гликопротеина. Гликопротеины оболочки вируса играют большую роль в индукции защитных иммунных реакций хозяина [20]. После заражения обнаружение VNA коррелирует с распознаванием гликопротеинов FHV [2].
У кошек FHV реплицируется в эпителиальных клетках конъюнктивы, верхних дыхательных путей, а также в нейронах [27]. Первичные места репликации FHV-1 включают в себя слизистую оболочку носовой перегородки, раковину, носоглотку, конъюнктиву и верхнюю часть трахеи, миндалины и нижнечелюстные лимфатические узлы. Вирус вызывает лизис эпителия носовой полости с распространением на конъюнктивальный мешок, глотку, трахею, бронхи и бронхиолы. Поражения характеризуются многоочаговым некрозом эпителия, инфильтрацией нейтрофильных гранулоцитов и воспалением.
Латентная хроническая инфекция ― результат острой инфекции, реактивация (например, на фоне стресса) приводит к выделению вируса из ротовой полости и секрета конъюнктивы. Основными источниками передачи вируса являются ороназальные и глазные выделения инфицированных кошек. Котята могут заражаться FHV от матерей ― носителей вируса [9].
В небольших популяциях здоровых кошек распространенность вируса составляет менее 1 %, тогда как в больших популяциях может достигать 20 % [1, 3, 11]. В приютах риск контаминации и инфицирования выше ― до 50 % [23].
Почти все кошки с первичной инфекцией становятся латентными носителями на протяжении всей жизни. Диагностических методов выявления скрытого носительства в настоящее время не разработано, поскольку вирус сохраняется в виде геномной ДНК в ядре латентно инфицированных нейронов без репликации. Выделение вируса может быть вызвано экспериментально ― путем введения глюкокортикоидов (70 %) или же происходить под воздействием стресса, такого, например, как лактация (40 %) или перемещение животного в новую для него среду (18 %) [6, 8, 9, 23]. После полного клинического выздоровления вирус может еще некоторое время обнаруживаться в смывах до полной его элиминации из организма.
Лабораторная диагностика ринотрахеита кошек в настоящее время чаще всего выполняется путем выделения возбудителя (VI, Virus Isolation) или ПЦР с использованием смывов из ротовой полости и конъюнктивы. VI позволяет выявить вирус и является лабораторным золотым стандартом диагностики [6, 18]. Антитела к FHV могут быть обнаружены с помощью теста нейтрализации или ELISA в сыворотке, слезах и спинномозговой жидкости [5, 19]. Прямых методов диагностики герпесвирусной инфекции при хроническом или латентном течении не разработано.
Клинические признаки заболевания: гиперсаливация, чихание и кашель, гипертермия, депрессия, анорексия, серозные или серозно-гнойные выделения из глаз и носа, гиперемия конъюнктивы. Зачастую процесс осложняется вторичной бактериальной инфекцией. Иногда наблюдают пневмонию и виремическое состояние с тяжелыми генерализованными признаками и летальным исходом [10]. Хронический риносинусит ― частая причина чихания и выделений из носа ― также связан с инфекцией. Однако в исследованиях вирусная ДНК обнаружена только у некоторых пораженных кошек [12], то есть вирус только инициирует состояние, которое затем поддерживается иммунно-опосредованными механизмами, что приводит к необратимому разрушению носовых раковин, костных структур и осложняется вторичной бактериальной инфекцией.
Руководство по лечению герпесвирусной инфекции кошек было опубликовано Европейским консультативным советом по болезням кошек (ABCD) [26] и включает в себя восстановление баланса жидкости, электролитов и кислотно-основного равновесия, применение антибиотиков широкого спектра действия с целью предотвращения бактериальной инфекции, противовирусных препаратов [26] и назначение симптоматического лечения.
Как уже было сказано ранее, при герпесвирусной инфекции особую роль в формировании иммунного ответа организма играют гликопротеины, встроенные в оболочку вируса. Благодаря им вырабатываются VNA, поскольку именно они (гликопротеины) являются основной мишенью вируснейтрализующих антител и распознаются организмом хозяина.
Основа иммунного ответа ― это реакции гуморального и клеточного иммунитета. Распознавание вирусных гликанов по PRR ― один из механизмов противовирусного ответа врожденного иммунитета. Рецепторы лектина С-типа (CLR) способны воспринимать гликаны, присутствующие в вирусных патогенах для активации иммунного ответа такими реакциями, как фагоцитоз, процессинг и презентация антигена и последующей активацией Т-клеток. MMR участвует в работе врожденного иммунитета путем распознавания гликановых структур на патогенах; способен распознавать остатки маннозы, фукозы и GlcNAc, которые присутствуют в гликопротеинах оболочки различных вирусов [14].
Рецептор маннозы является важным членом семейства лектиноподобных рецепторов С-типа. Он распознает гликозилированные молекулы, которые содержат остаток маннозы, трегалозную группу или остаток N-ацетилглюкозы. Многие рецепторы маннозы экспрессируются на поверхности макрофагов ― альвеолярных, перитонеальных и мононуклеарных (в крови) и играют важную роль в раннем иммунном ответе. После связывания с растительными полисахаридными лигандами рецепторы маннозы могут усиливать фагоцитарную активность макрофагов, продуцировать АФК, активировать фактор транскрипции NF-κB и индуцировать секрецию цитокинов.
Цитокины играют важную роль в регуляции межклеточных взаимодействий, воспалительных и иммунных реакций, оказывают регулирующее воздействие как на врожденный, так и на адаптивный иммунитет. Полисахариды могут стимулировать высвобождение цитокинов в макрофагах. Синергетический эффект воздействия цитокинов и полисахаридов растений на макрофаги также может активировать иммунный ответ макрофагов. Большинство исследований показали, что растительные полисахариды активируют макрофаги, распознавая специфические рецепторы на их поверхности и связываясь с ними, что вызывает иммунный ответ и оказывает иммуномодулирующее действие. Макрофаги могут связываться с полисахаридами и гликопротеинами растительного происхождения с помощью Toll-подобного рецептора 4 (TLR4), CD14, рецепторов комплемента 3 (CR3), акцептора (SR), маннозы (MR); дектина-1. Активация рецепторов макрофагов может инициировать серию внутриклеточных сигнальных каскадов, что приводит к активации транскрипции и синтезу связанных с воспалением цитокинов.
Многочисленные исследования показали, что растительные полисахариды регулируют иммунную систему несколькими способами и на разных уровнях. Они не только активируют иммунные клетки, в том числе Т-клетки, В-лимфоциты, макрофаги и естественные клетки-киллеры, но также активируют комплементы и стимулируют выработку цитокинов [28].
Активность растительных полисахаридов включает в себя иммунную регуляцию, противоопухолевые, противорадиационные и противовирусные эффекты [4, 13, 15, 29], а структура полисахаридов напрямую связана с их функциональной активностью [30]. Краловец и соавт. сообщили, что комплекс полисахарид / гликопротеин с молекулярной массой > 100 кДа, состоящий в основном из галактозы, рамнозы и арабинозы, обладает высокой биологической активностью [16]. Lo et al. исследовали арабинозу, маннозу, ксилозу и галактозу в качестве четырех наиболее важных моносахаридных компонентов, способствующих макрофагальной стимуляции [17].
«Форвет»® (раствор для инъекций) в качестве действующего вещества содержит 0,04 мг/мл панавира ― очищенного экстракта побегов Solanum tuberosum ― полисахаридного комплекса класса гексозных гликозидов, в состав которого входят, %: рамноза ― 2…10, арабиноза ― 3…15, глюкоза ― 10…67, галактоза ― 2…27, ксилоза ― 0,1…3, манноза ― 0,1…5, а также уроновые кислоты ― 2…5 и вспомогательные вещества ― натрия хлорид и вода для инъекций. Полисахаридный комплекс панавира, входящий в состав «Форвета»®, обладает цитопротективным действием, индуцирует синтез интерферона, тормозит репликацию вирусов в клетках.
Цель исследования
Определить эффективность применения препарата «Форвет»® в комплексной терапии инфекционного ринотрахеита (герпесвирусной инфекции FHV-1) кошек.
Материалы и методы
Эффективность препарата изучали в многоцентровом рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании, которое проводили в двух ветеринарных клиниках сети «Гелиэт» (Санкт-Петербург) в период с 09.01.2019 по 31.12.2019.
В эксперимент включили 120 кошек в возрасте от 5 до 6 месяцев, МТ 1,5…2 кг, с диагнозом «инфекционный ринотрахеит кошек», поставленным на основании результатов диагностических исследований (анамнез, ПЦР, клинический анализ крови, температура тела, истечения из глаз и носовой полости, наличие поражений на слизистых оболочках). Все животные были подобраны на улицах для дальнейшего лечения и распределения в приюты города.
Каждое животное, которое соответствовало критериям включения, было рандомизировано в одну из двух групп, при этом вероятность случайного распределения в одну из групп составляла 50 %. Животным присваивали рандомизационный номер, в соответствии с которым назначали лечение. Животным одной группы вводили исследуемый препарат («Форвет»®), а кошки другой группы (плацебо группа) получали физиологический раствор вместо противовирусного препарата.
Диагноз «ринотрахеит кошек» ставили комплексно на основании клинических признаков (серозный / гнойный конъюнктивит, ринит, гиперсаливация, лихорадка, гиперемия и отечность слизистой носоглотки, чихание, отсутствие аппетита), для подтверждения диагноза использовали ПЦР (исследовали смывы с конъюнктивы глаз, носового прохода и ротовой полости) и общий клинический анализ крови (на базе ветеринарной лабораторной службы ― «ВЕТТЕСТ»).
ПЦР и клинический анализ крови были выполнены в день обращения животного (для подтверждения диагноза), на 5-й и 10-й дни лечения.
Схема лечения была едина для всех животных и включала в себя применение антибактериального препарата (синулокс) в течение 10 дней согласно инструкции; обработка глаз лосьоном (ромашка), глазной мазью (тетрациклин 1 %) ― 2 раза в день,7 дней. Группе №1 (плацебо) вводили изотонический раствор натрия хлорида, группе №2 (подопытная) применяли препарат «Форвет»® ― в дозе 1 мл, один раз в день, п/к в течение 10 дней. Животным в тяжелом состоянии дополнительно вводили 5%-й раствор глюкозы ― 50 мл в/в, один-два раза в день, до появления аппетита.
В период исследования гибель животных не зафиксирована. Осложнений при применении препаратов не обнаружено. Животных с сочетанной инфекцией в группы не включали.
Результаты и обсуждение
В ходе исследования животные были осмотрены ветеринарным специалистом с документальным фиксированием клинических признаков на 1-й, 3-й, 5-й, 7-й и10-й дни лечения. Также на 1-й, 5-й и 10-й дни брали пробы биоматериала из носовой, ротовой полостей и с поверхности конъюнктивы для определения титра вируса (в ПЦР) и пробы крови для общего клинического анализа. Полученные результаты были систематизированы, внесены в таблицы и проанализированы.
В таблице 1 представлены результаты по изучению динамики изменения клинических признаков у животных подопытной и контрольной групп.
1. Динамика изменения клинических признаков у животных подопытной и контрольной групп
The dynamics of changes in clinical signs in animals of the experimental and control groups
|
День исследования |
Группа |
Температура тела |
Истечения из носа / % к количеству в группе |
Истечения из глаз / % к количеству в группе |
Чихание / % к количеству в группе |
Отсутствие аппетита / % к количеству в группе |
||||
|
1 |
Плацебо |
39,5±0,11 |
55 |
91,66 |
49 |
81,66 |
45 |
75,00 |
36 |
64,00 |
|
«Форвет»® |
39,5±0,18 |
41 |
68,33 |
57 |
95,00 |
37 |
61,66 |
26 |
43,33 |
|
|
3 |
Плацебо |
38,8±0,12 |
56 |
93,33 |
53 |
88,33 |
46 |
76,66 |
14 |
23,33 |
|
«Форвет»® |
38,8±0,19 |
50 |
83,33 |
58 |
96,66 |
22 |
36,66 |
7 |
11,66 |
|
|
5 |
Плацебо |
38,7±0,09 |
57 |
95,00 |
53 |
88,33 |
36 |
60,00 |
0 |
0,00 |
|
«Форвет»® |
38,5±0,13 |
41 |
68,33 |
58 |
96,66 |
11 |
18,33 |
0 |
0,00 |
|
|
7 |
Плацебо |
38,6±0,11 |
52 |
86,66 |
49 |
81,66 |
23 |
38,33 |
0 |
0,00 |
|
«Форвет»® |
38,5±0,10 |
20 |
33,33 |
30 |
50,00 |
0 |
0,00 |
0 |
0,00 |
|
|
10 |
Плацебо |
38,5±0,08 |
20 |
33,33 |
27 |
45,00 |
19 |
31,66 |
0 |
0,00 |
|
«Форвет»® |
38,4±0,09 |
3 |
5,00 |
6 |
10,00 |
0 |
0,00 |
0 |
0,00 |
|
У большей части животных при первичном приеме отмечали истечения из носа и глаз, чихание, снижение аппетита и незначительную гипертермию. При первичном обследовании у 80,0 % животных наблюдали истечения из носа, у 88,33 % ― из глаз, у 68,33 % ― чихание, у 51,66 % ― отсутствие аппетита. По группам животных регистрировали следующие клинические признаки, %: группа плацебо ― истечения из носа (91,66), истечения из глаз (81,66), чихание (75), снижение аппетита (64). В подопытной группе животных, %: истечения из носа (68,33), истечения из глаз (95), чихание (61,66), отсутствие аппетита (43,33). Подробно результаты динамики изменений клинических признаков приведены в таблице 1.
На 3-й день эксперимента в подопытной группе и в группе плацебо число животных с проявлением клинических признаков в виде истечений из глаз и носа увеличилось, число животных с такими признаками, как гипертермия, отсутствие аппетита и чихание, уменьшилось.
На 5-й день эксперимента в подопытной группе наблюдали уменьшение следующих клинических признаков: истечения из носа, чихание, что снижает возможность возникновения осложнений, так как отсутствуют условия для развития вторичной бактериальной инфекции.
Из данных таблицы 1 видно, что в подопытной группе при применении препарата «Форвет» ® клиническое выздоровление наступало быстрее, чем в группе плацебо.
В таблице 2 приведены результаты клинического исследования крови кошек подопытной и контрольной групп.
2. Результаты клинического исследования крови подопытной и контрольной групп
The results of a clinical study of blood of the experimental and control groups
|
Показатель |
Нормы лаборатории |
День 1 |
День 5 |
День 10 |
|||
|
Плацебо |
Форвет® |
Плацебо |
Форвет® |
Плацебо |
Форвет® |
||
|
Эритроциты, х1012/л |
5…10 |
8,15±1,35 |
8,44±1,32 |
8,20±1,19 |
8,42±0,68 |
7,54 ±0,77 |
8,90 ±0,97 |
|
Гемоглобин, г/л |
80…150 |
113,58 ±14,76 |
119,44±20,99 |
114,2±10,97 |
119,57±15,04 |
111,38±10,29 |
120,35±18,81 |
|
Гематокрит, % |
24…45 |
34,62 ±4,68 |
36,56±5,63 |
35,00±4,01 |
37,19±3,67 |
34,60±5,10 |
35,23±5,28 |
|
Общий объем эр., Фл |
39…55 |
41,97±3,72 |
44,25±3,13 |
42,18±3,81 |
43,95±3,89 |
39,65±2,82 |
42,66±2,88 |
|
Среднее содержание Нb в эр., пг |
13…17 |
14,5±1,14 |
14,25±1,13 |
14,86±0,98 |
14,68±1,01 |
14,53±1,20 |
14,56±1,15 |
|
Средняя концентрация Hb в эр., г/л |
300…360 |
324,59±14,32 |
326,00±14,53 |
326,75±13,12 |
329,78±14,10 |
324,55±14,76 |
331,63±13,29 |
|
Распределение эритроцитов в крови, % |
14…31 |
17,32 ±2,74 |
16,23±1,61 |
15,75±1,67 |
16,10±1,89 |
15,00 ±0,92 |
15,19±0,77 |
|
Лейкоциты, x109/л |
5,5…19,5 |
10,35 ±0,89 |
10,55±1,54 |
10,63±0,85 |
11,67±2,45 |
9,96 ±1,23 |
8,92 ±1,41 |
|
Палочкоядерные нейтрофилы, % x109/л |
0…3 |
2,68 ±0,87 0,28 ±0,06 |
2,51±1,11 0,26±0,06 |
4,68±0,94 0,49±0,06 |
1,05±0,89 0,12±0,08 |
2,0 ±1,05 0,19 ±0,07 |
2,88 ±0,73 0,25 ±0,09 |
|
Сегментояденые нейтрофилы % x 109/л |
35…75 3,96…14,04 |
33,78±2,61 3,5±0,39 |
34,98±2,41 3,69±0,45 |
37,98±3,77 4,04 ±0,7 |
35,07±2,6 4,09±0,71 |
41,01±5,42 4,08±0,5 |
46,71±3,54 4,16 ±0,78 |
|
Эозинофилы % x109/л |
2…12 0,33…1,17 |
2,96±1,22 0,31±0,08 |
3,38±1,2 0,36±0,12 |
3,61±1,04 0,39±0,11 |
3,03±0,80 0,35±0,09 |
2,1±0,75 0,20±0,08 |
3,95 ±1,04 0,35 ±0,15 |
|
Базофилы % x109/л |
0…1 - |
0,00 0,00 |
0,00 0,00 |
0,00 0,00 |
0,00 0,00 |
0,00 0,00 |
0,00 0,00 |
|
Моноциты, % x109/л |
0…4 - |
2,14±0,73 0,22±0,04 |
2,03±0,84 0,22±0,05 |
2,01±0,59 0,21±0,05 |
1,27±0,54 0,14±0,04 |
2,2±0,73 0,21±0,08 |
1,3±0,46 0,12±0,04 |
|
Лимфоциты% x109/л |
20…55 1,21…4,29 |
58,44±2,85 6,04±0,67 |
57,1±2,46 6,02±0,91 |
51,72±2,15 5,50±0,33 |
59,58±3,65 6,99±0,62 |
52,69±3,72 5,28±0,37 |
45,16±2,08 4,02±0,49
|
|
Тромбоциты, x109/л |
200…600 |
209,45±21,88 |
218,82±40,16 |
202,13±12,43 |
248,33±24,45 |
213,18±23 |
231,07±80,13 |
|
Средний объем тромбоцитов, Фл |
0…99,9 |
9,73±1,34 |
9,84±1,06 |
9,23±1,36 |
10,04±1,73 |
11,02±1,65 |
12,78±1,83 |
Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что у всех животных при первичном приеме регистрировали лимфоцитоз, связанный с наличием инфекционного процесса в организме, снижение количества сегментоядерных нейтрофилов, что указывает на распространение инфекции. К пятому дню в подопытной группе наблюдается достоверное повышение содержания лимфоцитов (р=0,03(St)), которое происходит в результате действия препарата «Форвет» ® на секрецию цитокинов, пролиферацию иммунных клеток и фагоцитарную активность макрофагов (согласно исследованию, Yin M. 2019, о полисахаридных комплексах). На 5-й день опыта отмечен лейкоцитарный сдвиг влево (относительное увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов) в плацебо группе, характерный для острой стадии воспалительного процесса, чего не наблюдали в подопытной группе.
К 10-му дню лечения в клиническом анализе крови наблюдали дальнейшее снижение количества лимфоцитов в обеих группах, при этом в плацебо группе это происходило медленнее, чем в подопытной. Возвращение количества лимфоцитов (р=0,04(St.)) в пределы физиологической нормы обусловлено завершением иммунного ответа и, как следствие, быстрой гибелью эффекторных лимфоцитов (Т-хелперы и Т-киллеры). Таким образом, мы можем сделать вывод, что в группе, получавшей препарат «Форвет»® выздоровление происходило быстрее, чем в группе плацебо.
В таблице 3 представлены результаты по изучению динамики изменения титра возбудителя Feline herpesvirus 1 при исследовании методом ПЦР у животных подопытной и контрольной групп.
3. Динамика изменения титра возбудителя Feline herpesvirus 1 при исследовании методом ПЦР у животных подопытной и контрольной групп (количество инфекционного агента на клетку)
The dynamics of changes in the titer of the pathogen Feline herpesvirus 1 when tested by PCR in animals of the experimental and control groups (the amount of infectious agent per cell)
|
День исследования |
Группы |
|
|
Плацебо |
«Форвет»® |
|
|
1 |
312,83±68,19 |
343,83±87,31 |
|
150,17±38,27 |
116,33±39,16 |
|
|
10 |
42,5±29,81 |
5,0±7,85 |
Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что у животных подопытной группы наблюдали достоверно ускоренную, по сравнению с контрольной группой животных, элиминацию вируса из организма (р=0,01(W)).
Рис. Динамика титра возбудителя у подопытной и контрольной групп животных
Fig. The dynamics of the titer of the pathogen in the experimental and control groups of animals
Выводы
На основании анализа результатов многоцентрового рандомизированного плацебо-контролируемого исследования установлена клиническая эффективность препарата «Форвет»® ― полисахаридного комплекса класса гексозных гликозидов в составе комплексной терапии инфекционного ринотрахеита (герпесвирусной инфекции FHV-1) кошек. В группе животных, которым применяли «Форвет»® наблюдали более быструю элиминацию вируса, возвращение показателей крови в пределы физиологической нормы, уменьшение выраженности клинических признаков заболевания уже к пятому дню и практически полное клиническое выздоровление к седьмому дню лечения, по сравнению с плацебо группой.
Конфликт интересов.
Разработчиком препарата «Форвет»® для ветеринарного применения и спонсором данного исследования является ООО «Национальная Исследовательская Компания». Решение о публикации результатов научной работы принадлежит ООО «Национальная Исследовательская Компания».
