COMPARATIVE STUDY OF INDICATORS OF TOXIC ACTIVITY IN THE ALLIUM-TEST
Rubrics: BIOLOGY
Authors:
1.
Vserossiyskiy nauchno-issledovatel'skiy institut tehnologii konservirovaniya - filial Federal'nogo gosudarstvennogo byudzhetnogo nauchnogo uchrezhdeniya «Federal'nyy nauchnyy centr pischevyh sistem im. v. m. Gorbatova» RAN
2.
Vserossiyskiy nauchno-issledovatel'skiy institut tehnologii konservirovaniya - filial Federal'nogo gosudarstvennogo byudzhetnogo nauchnogo uchrezhdeniya «Federal'nyy nauchnyy centr pischevyh sistem im. v. m. Gorbatova» RAN
3.
Vserossiyskiy nauchno-issledovatel'skiy institut tehnologii konservirovaniya - filial Federal'nogo gosudarstvennogo byudzhetnogo nauchnogo uchrezhdeniya «Federal'nyy nauchnyy centr pischevyh sistem im. v. m. Gorbatova» RAN
4.
the All-Russian Research Institute of Canning Technology, Branch of the Federal Research Center of Food Systems named after V.M. Gorbatov of RAS
( Head of the Laboratory)
Russian Federation
Russian Federation
Type:
Article
Pages:
from 25
to 30
Status:
Published
Received:
16.01.2019
Accepted:
23.01.2023
Published:
25.04.2018
Subject area:
UDK 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
Language:
Russian
Keywords:
allium test, toxicity, root growth dynamics, mutagen
Abstract (English):
The allium test is one of the most popular methods for assessing the toxic, mutagenic and mitosis-modifying effects of various chemical, physical and biological factors and is recommended by WHO experts as a standard for cytogenetic monitoring of the environment. In this test, the roots of onions are used as a test object. In accordance with the procedure of this test, a toxicity test should be performed before the cytogenetic analysis, in which a parameter such as root growth is examined. At the same time, the most accurate and at the same time the most time-consuming method remained, based on measuring the average length of roots for the entire sample of bulbs. The work is devoted to the evaluation of the effectiveness of using such a macroscopic index for detecting the toxicity of mitogens, as the mass of the roots of onions, using the Allium test. When setting up experiments with the standard positive control (copper sulphate solution) for this test, the same significant decrease in both the mean length and the average root mass was shown, while the sensitivity of the root weight was even 3.2 % higher. Similar data were obtained with a model toxic agent – ethyl alcohol, regardless of the onion variety, duration and temperature of the incubation or type of water from which the solution was prepared (distilled and bottled). As a result of the research it was shown that the method of measuring the average mass of bulb roots in the Allium test can be used as the standard parameter of root growth, which is the most simple in application and sensitive.
The allium test is one of the most popular methods for assessing the toxic, mutagenic and mitosis-modifying effects of various chemical, physical and biological factors and is recommended by WHO experts as a standard for cytogenetic monitoring of the environment. In this test, the roots of onions are used as a test object. In accordance with the procedure of this test, a toxicity test should be performed before the cytogenetic analysis, in which a parameter such as root growth is examined. At the same time, the most accurate and at the same time the most time-consuming method remained, based on measuring the average length of roots for the entire sample of bulbs. The work is devoted to the evaluation of the effectiveness of using such a macroscopic index for detecting the toxicity of mitogens, as the mass of the roots of onions, using the Allium test. When setting up experiments with the standard positive control (copper sulphate solution) for this test, the same significant decrease in both the mean length and the average root mass was shown, while the sensitivity of the root weight was even 3.2 % higher. Similar data were obtained with a model toxic agent – ethyl alcohol, regardless of the onion variety, duration and temperature of the incubation or type of water from which the solution was prepared (distilled and bottled). As a result of the research it was shown that the method of measuring the average mass of bulb roots in the Allium test can be used as the standard parameter of root growth, which is the most simple in application and sensitive.
Keywords:
allium test, toxicity, root growth dynamics, mutagen
allium test, toxicity, root growth dynamics, mutagen
Положительная рецензия представлена А. Г. Галстян, заведующим межотраслевым центром мониторинга качества пищевых продуктов ВНИИ пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности - филиала ФГБНУ «ФНЦ пищевые системы» РАН, доктором технических наук, членом-корреспондентом РАН. В научной литературе широко обсуждается про- блема влияния токсических и генотоксических фак- торов окружающей среды на качество жизни и здоро- вье населения. Для изучения этих воздействий про- водятся мониторинговые исследования с целью вы- явления мутагенов, в том числе в составе продуктов питания, так как в последнее время допущено к ис- пользованию огромное число пищевых химических и иных добавок как в самом продукте, так и в сырье. В связи с этим были разработаны и рекомендованы различные тест-системы на биологических моделях в условиях in vivo и in vitro с целью изучения меха- низмов воздействия этих мутагенов. Аллиум-тест известен с 40-х гг. прошлого столе- тия и зарекомендовал себя как простой, экономиче- ски выгодный, довольно чувствительный и хорошо коррелирующий с другими тестами, в том числе на животных [1, 2]. Принцип его действия основан на сравнительном изучении параметров роста и раз- вития меристематических тканей корешков расте- ния Allium cepa - лук репчатый - при добавлении в ростовую среду тестируемого агента. Аллиум-тест позволяет проводить оценку токсических (задерж- ка в приросте корешков), митозмодифицирующих и мутагенных эффектов различных митогенов (цитоге- нетический анализ). С помощью этого биотеста воз- можно быстрое проведение скрининга на безопас- ность в отношении химических соединений, тяже- лых металлов, радиации, различных электромагнит- ных излучений и других техногенных загрязнителей [1]. А при тестировании на токсичность и геноток- сичность таких потенциально опасных соединений, как пестициды, пищевые добавки, красители, угле- водороды, он оказался даже более чувствительным по сравнению с другими биологическими тестами, такими как клеточные линии, микроорганизмы и жи- вотные [2-7]. Полагаем, что было бы интересно оце- нить эффективность Аллиум-теста, например, при сравнении с моделями стволовых клеточных линий [8, 9], так как меристематическая ткань корней со- стоит из интенсивно делящихся клеток. Оказалось также, что растительные клетки содержат специфи- ческие ферменты, которые способны активировать определенные промутагены, поэтому данный тест может быть использован для изучения как канцеро- генных, так и антиканцерогенных свойств химиче- ских соединений [10]. Таким образом, Аллиум-тест до настоящего времени представляет собой уни- кальный инструмент быстрого скрининга различных агентов и воздействий. Считается, что стандартным цитотоксическим па- раметром Аллиум-теста, определяющим динамику роста корней лука, является их длина [2]. В случае задержки прироста корней по сравнению с контро- лем фиксируют токсический эффект тестируемого агента, и наоборот, при увеличении скорости роста - стимулирующий. В связи с тем обстоятельством, что число корней от одной луковицы может измеряться десятками единиц (в зависимости от периода инку- бации), процедура их измерения представляется до- вольно трудоемкой. Было предложено несколько мо- дификаций этого метода для того, чтобы облегчить эту процедуру. Так, предлагалось проводить только одно измерение средней длины «пакета» корней, или длины нескольких (5 и более) наиболее развитых корней, а также использовать фотографический ме- тод [11]. Следует отметить, что указанные модифи- кации имели определенные недостатки, так как они или повышали ошибку измерений длины корней, или предполагали наличие специального оборудо- вания, поэтому потребность в разработке простого и эффективного метода выявления цитотоксичности для данного теста до сих пор не была снята. На наш взгляд, динамика массы корней, возмож- но, является не менее точным показателем, чем их длина. Интересно, что нам удалось найти только одну экспериментальную работу, в которой при про- ведении Аллиум-теста в качестве совокупного ма- кроскопического показателя наряду с длиной корней оценивалась их масса [12]. Действительно, тот факт, что длина корней непосредственно связана с массой корней, не требует обсуждения, однако известно, что при обработке токсичным фактором корни лука не только задерживаются в приросте, но и становятся тоньше и слабее [2], таким образом, их масса являет- ся более чувствительным показателем. цель и методика исследований. Цель исследо- вания - сравнительное изучение двух методов выяв- ления цитотоксичности при использовании Аллиум- теста. Было необходимо оценить эффективность ис- пользования таких макроскопических показателей, как длина и масса корней лука, при тестировании растворов медного купороса и этилового спирта. В работе использовали примерно одинакового размера (1,5-2,0 и 2,5-3 см в диаметре) и массы (4-5 и 5-7 г) луковицы - севок (Allium cepa L.) сортов Штутгартен Ризен и Стурон соответственно. Луко- вицы были без зеленых листьев. Перед инкубацией удаляли сухую чешую с луковиц. Далее их помещали в случае контрольных групп в 10 мл пробирки с дис- тиллированной или бутилированной питьевой водой из торговой сети, в опытных группах - в растворы медного купороса (0,6 мг/л) и этанола (1 и 2 %) соот- ветствующей контролю воды и инкубировали в тем- ноте при комнатной температуре или в инкубаторе при 25 ºС. Жидкость в пробирках менялась ежеднев- но. После завершения инкубации корни у каждой луковицы срезали, удаляли с них остатки жидкости фильтровальной бумагой, взвешивали и измеряли линейкой их длину. Динамика изменений длины и массы корней луковиц сорта Стурон после обработки раствором медного купороса в течение трех суток (n = 10) Table 1 Dynamics of changes in length and weight of bulb roots of Sturon after treatment with a solution of copper sulfate within three days (n = 10) Показатели Indicators Длина корней, см Root length, cm Масса корней, мг Root weight, mg X % от контроля % of control X % от контроля % of control Контроль Control 47,15ª 100 134,5ᶜ 100 Медный купорос Copper sulfate 25,85ᵇ 54,8 69,4ᵈ 51,6 Примечание: a,b; c,dР < 0,01. Note: a,b; c,dР < 0.01. Таблица 2 Динамика изменений длины и массы корней луковиц сорта Стурон после обработки растворами этанола в течение трех суток (n = 10) Table 2 Dynamics of changes in length and weight of bulb roots of Sturon after treatment with a solution of ethanol sulfate within three days (n = 10) Показатели Indicators Длина корней, см Root length, cm Масса корней, мг Root weight, mg X % от контроля % of control X % от контроля % of control Контроль Control 13,78ᵃ 100 31,2ᶜ 100 Этанол (1 %) Ethanol (1 %) 7,47ᵇ 54,2 14,9ᵈ 47,8 Этанол (2 %) Ethanol (2 %) 5,60 40,6 11,8 37,8 Примечание: a,b; c,d Р < 0,05. Note: a,b; c,d Р < 0.05. результаты исследования. Ионы меди являют- ся незаменимым микроэлементом в различных фер- ментативных процессах растительной клетки, также как и другие ионы тяжелых металлов. Однако из-за высокой активности превышение допустимых норм содержания ионов меди в воде или почве может ока- зывать отрицательное воздействие на рост корней растений. Было показано, что ионы меди облада- ют высоким токсичным эффектом по сравнению с другими и могут быть использованы в качестве по- ложительного контроля в Аллиум-тесте, при этом концентрация медного купороса 0,6 мг/л вызывала 50 %-ю задержку роста длины корней [2, 13]. Поэто- му в первом эксперименте по сравнительной оценке динамики длины и массы корней после токсического воздействия нами была использована эта стандарт- ная модель для Аллиум-теста. Контрольные лукови- цы помещали в пробирки с бутилированной водой, опытные - в раствор медного купороса на этой же воде и инкубировали их в термостате при 25 ºС. Как видно из табл. 1, полученные результаты с высокой достоверностью (P < 0,01) подтверждали литератур- ные данные [2, 13] об уменьшении примерно на 50 % средней длины корней в опытной группе. При этом с такой же достоверностью и в той же пропорции в опытной группе снизилась средняя масса корней. Значит, такой показатель токсичности в Аллиум-те- сте, как масса корней, показал себя не менее эффек- тивным, чем их длина. В качестве следующего модельного агента был выбран этиловый спирт, который используется не только в спиртосодержащей пищевой продукции, но и как растворитель для пищевых ароматизаторов и в качестве консерванта в хлебобулочной промыш- ленности. Известно, что 1 и 2 %-е растворы этило- вого спирта оказывают существенное токсическое действие на длину корней [2]. Необходимо также от- метить, что при постановке Аллиум-теста в первона- чальном варианте исследователи использовали луко- вицы, корни которых проращивались до 1-2 см, об- работка изучаемым веществом продолжалась 4 или 24 ч при температуре инкубации 20 ºС. Затем в ли- тературе появились различные модифицированные способы постановки этого теста, например без пред- варительного проращивания, с более длительной ин- кубацией (3-5 дней), более высокой температурой инкубации (до 25 ºС) и другие варианты [2, 14]. По- этому нами были протестированы несколько вариан- Таблица 3 Динамика изменений длины и массы корней луковиц сорта Штутгартен Ризен после обработки растворами этанола в течение шести суток (n = 7) Table 3 Dynamics of changes in length and weight of bulb roots of Stuttgart Riesen after treatment with a solution of ethanol sulfate within six days (n = 7) Показатели Indicators Длина корней, см Root length, cm Масса корней, мг Root weight, mg X % от контроля % of control X % от контроля % of control Контроль Control 45,76 100 176,9 100 Этанол (1 %) Ethanol (1 %) 31,84 69,6 116,6 65,9 Этанол (2 %) Ethanol (2 %) 27,56 60,2 104,9 59,3 Таблица 4 Динамика изменений длины и массы корней луковиц сорта Штутгартен Ризен после обработки растворами этанола в течение трех суток (1-я партия, n = 8) Table 4 Dynamics of changes in length and weight of bulb roots of Stuttgart Riesen after treatment with a solution of ethanol sulfate within three days (1st batch, n = 8) Показатели Indicators Длина корней, см Root length, cm Масса корней, мг Root weight, mg X % от контроля % of control X % от контроля % of control Контроль Control 20,14ᵃ 100 73,9ᶜ 100 Этанол (1 %) Ethanol (1 %) 14,46ᵇ 71,8 47,4ᵈ 64,1 Этанол (2 %) Ethanol (2 %) 13,20 65,5 39,9 54,0 Примечание: a,bР < 0,1; c,d Р < 0,15. Note: a,bР < 0,1; c,d Р < 0,15. тов постановки Аллиум-теста с целью оценки точ- ности метода измерения массы корней по сравнению с методом измерения длины корней. Были изучены такие параметры, как сорт лука, продолжительность и температура инкубации, виды воды (дистиллиро- ванная и бутилированная) после проращивания луко- виц в 1 и 2 %-х растворах этилового спирта. Результаты эксперимента, в котором опытные группы луковиц инкубировались в 1 и 2 %-х раство- рах этилового спирта в бутилированной воде, в кон- трольной группе - в бутилированной воде при ком- натной температуре 20-21 ºС в течение трех суток, представлены в табл. 2. Было показано достоверное токсическое влияние данных растворов как на длину корней, так и на их массу, при этом в последнем ва- рианте чувствительность была даже несколько выше. В следующем исследовании использовали лук сорта Штутгартен Ризен, инкубацию проводили в течение шести суток в дистиллированной воде при комнатной температуре в летний период (24-26 ºС). Согласно табл. 3 были отмечены те же закономерно- сти, что и в вышеописанных экспериментах. Как из- вестно, в дистиллированной воде рост корней замедляется по сравнению с бутилированной [2], поэтому, возможно, разница между контрольными и опытны- ми группами сократилась. Далее был поставлен эксперимент с этим же сор- том лука с предварительным проращиванием луко- виц и дальнейшей инкубацией с растворами этило- вого спирта в дистиллированной воде в течение трех и четырех суток в осенний период (20-22 ºС). После предварительного проращивания в течение трех су- ток в дистиллированной воде луковицы были поде- лены на две партии. В первой партии часть корней достигала длины более 1 см, во второй все корни были менее 1 см. Затем луковицы были помещены в растворы этилового спирта в дистиллированной воде. Оказалось, что при данной постановке опыта подтвердились прежние результаты, так как процент- ное соотношение длины и массы корней было очень похожим, более того, вновь показатель массы корней был более чувствительным (табл. 4, 5) и даже наблю- дался доза зависимый эффект (табл. 5). Интересно отметить, что чувствительность теста на токсичность увеличивалась (до 20 %), если использовались луко- вицы с низким потенциалом проращивания корней Таблица 5 Динамика изменений длины и массы корней луковиц сорта Штутгартен Ризен после обработки растворами этанола в течение четырех суток (2-я партия, n = 8) Table 5 Dynamics of changes in length and weight of bulb roots of Stuttgart Riesen after treatment with a solution of ethanol sulfate within four days (2 batch, n = 8) Показатели Indicators Длина корней, см Root length, cm Масса корней, мг Root weight, mg X % от контроля % of control X % от контроля % of control Контроль Control 13,83ᵃ 100 45,8ᵈ 100 Этанол (1 %) Ethanol (1 %) 6,95ᵇ 50,3 22,1ᵉ 48,3 Этанол (2 %) Ethanol (2 %) 5,23ᶜ 37,8 15,4ᶠ 33,6 Примечание: a,b; a,c; d,e; d,fР < 0,05; b,c Р < 0,25; e,f Р < 0,3. Note: a,b; a,c; d,e; d,fР < 0,05; b,c Р < 0,25; e,f Р < 0,3. (табл. 5). Согласно литературным данным величина длины корней зависела от условий проведения экс- перимента и сорта лука [2, 14], наши исследования показали, что продолжительность и температура ин- кубации, параметры воды и сорт лука также оказыва- ли влияние на длину и массу корней. На основании проведенных исследований можно сделать заключе- ние, что метод взвешивания корней при постановке Аллиум-теста будет более эффективным и чувстви- тельным при использовании бутилированной воды с инкубацией тестируемого агента не более трех суток в термостате при 25 ºС. выводы и рекомендации. Сравнительный ана- лиз задержки прироста корней лука по их длине по сравнению с их массой при тестировании с положи- тельным контролем (ионы меди) и с опытными об- разцами (1 и 2 %-е растворы этилового спирта) по- казал, что параметр массы может быть использован в качестве самостоятельного эффективного показа- теля токсичности в Аллиум-тесте. При этом метод взвешивания корней имел ряд неоспоримых преиму- ществ, а именно был намного менее трудоемким, так как необходимо выполнить только одно измерение на вариант, и более чувствительным. Полагаем, что метод взвешивания корней может не только допол- нять традиционный метод измерения их длины, но и с успехом заменить последний.
1. Khanna N., Sharma S. Allium cepa root chromosomal aberration assay: a review // Indian J. Pharm. Biol. Res. 2013. Vol. 1. № 3. P. 105-119.
2. Fiskesjo G. The Allium test as a standard in environmental monitoring // Hereditas. 1985. Vol. 102. P. 99-112.
3. Roa O., Yeber M. C., Venegas W. Genotoxicity and toxicity evaluations of ECF cellulose bleaching effluents using the Allium cepa L. Test // Braz. J. Biol. 2012. Vol. 72. № 3. P. 471-477.
4. Olusegun E. Th., Olajire A. A. Toxicity of food colours and additives: A review // African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2015. Vol. 9. № 36. P. 900-914.
5. Türkoğlu Ş. Evaluation of genotoxic effects of five flavour enhancers (glutamates) on the root meristem cells of Allium cepa // Toxicol Ind. Health. 2015. Vol. 31. № 9. P. 792-801.
6. Nunes R. D. M., Sales I. M. S., Silva S. I. O., Sousa J. M. C., Peron A. P. Antiproliferative and genotoxic effects of nature identical and artificial synthetic food additives of aroma and flavor // Braz J Biol. 2017. Vol. 77. № 1. P. 150-154.
7. Moura A. G., Santana G. M., Ferreira P. M., Sousa J. M., Peron A. P. Cytotoxicity of Cheese and Cheddar Cheese food flavorings on Allim cepa L root meristems // Braz J Biol. 2016. Vol. 76. № 2. P. 439-443.
8. Suraeva N. M., Vorotelyak E. A., Prokof'ev M. I., Samoylov A. V., Vasil'ev A. V., Terskih V. V., Ba- ryshnikov A. Yu. Poluchenie, harakteristika i dolgosrochnoe kul'tivirovanie primordial'nyh polovyh i blastodermal'nyh kletok kur // Doklady Akademii nauk. 2008. T. 423. № 3. S. 408-410.
9. Suraeva N. M., Morozova L. F., Samoylov A. V., Burova O. S., Golubeva V. A., Baryshnikova M. A., Ba- ryshnikov A. Yu. Izmenenie morfologicheskih i immunologicheskih harakteristik kletok melanomnoy li- nii (mel ibr) v rezul'tate vozdeystviya kurinogo embrional'nogo ekstrakta // Byulleten' eksperimental'noy biologii i mediciny. 2015. T. 159. № 4. S. 521-524.
10. Felicidade I., Lima J. D., Pesarini J. R., Monreal A. C. Mantovani M. S., Ribeiro L. R., Oliveira R. J. Mutagenic and antimutagenic effects of aqueous extract of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) on meristematic cells of Allium cepa // Genet Mol Res. 2014. Vol. 13. № 4. P. 9986-9996.
11. Budancev A. Yu. Izmerenie dinamiki rosta korney pri ispol'zovanii Allium-testa // Fundamental'- nye issledovaniya. 2014. № 6. S. 1393-1396.
12. Çavuşoğlu K., Yalçin E., Türkmen Z., Yapar K., Sağir S. Physiological, anatomical, biochemical, and cytogenetic effects of thiamethoxam treatment on Allium cepa (amaryllidaceae) L // Environ Toxicol. 2012. Vol. 27. № 11. P. 635-643.
13. Athanásio C. G., Prá D., Rieger A. Water quality of urban streams: The Allium cepa seeds/seedlings test as a tool for surface water monitoring // Scientific World Journal. 2014. P. 1-7.
14. Pesnya D. S., Romanovskiy A. V., Prohorova I. M. Issledovanie toksicheskogo i genotoksicheskih effek- tov sinteticheskih pischevyh krasiteley metodom Allium test // Yaroslavskiy pedagogicheskiy vestnik. 2012.
