В настоящее время утвердилось представление о том, что многие заболевания в период беременности, в том числе инфекционного генеза, сопровождаются развитием окислительного стресса, связанного с усиленным генерированием активных форм кислорода [3, 7]. Одной из мишеней их действия являются соединения липидной природы, которые входят в состав клеточных мембран, а также внутриклеточных белково-липидных комплексов [14]. Деструктивное действие активных форм кислорода на липидные компоненты клеток приводит к образованию первичных (диеновые конъюгаты – ДК) и, в дальнейшем, конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), накопление которых представляет определенную опасность для развивающегося организма [4]. Помимо этого, развитие окислительного стресса в период гестации обусловливает высвобождение провоспалительных цитокинов и апоптотических фрагментов, которые, наряду с продуктами ПОЛ, оказывают непосредственное токсическое влияние на плод, вызывая полиорганные нарушения различного характера [15]. В связи с вышеизложенным представляло интерес изучить особенности изменений показателей свободно-радикального статуса, антиоксидантной защиты и морфологические изменения эритроцитов периферической крови беременных женщин первого триместра с обострением цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции.
Материалы и методы исследования
Проведено проспективное исследование 70 беременных женщин в первом триместре гестации, давшим добровольное информированное согласие на участие в обследовании. Основная группа была представлена 35 пациентками с обострением ЦМВ инфекции, контрольная группа включала 35 практически здоровых женщин, сопоставимых по сроку и возрасту.
Критериями включения в исследование явились лабораторно подтвержденное обострение ЦМВ инфекции в первом триместре беременности, стойкая клиническая ремиссия герпесвирусной инфекции.
Критерии исключения из исследования: первичная ЦМВ инфекция, обострение других воспалительных заболеваний экстрагенитальной патологии, наличие инфекций, передающихся половым путем.
Клинический диагноз первичной ЦМВ инфекции устанавливали по наличию в периферической крови антител IgМ к ЦМВ, низкоавидных IgG (индекс авидности <50%), а также ДНК ЦМВ, выявляемой методом полимеразной цепной реакции в крови или моче; обострение хронической ЦМВ инфекции – по наличию IgМ к ЦМВ, высокоавидных IgG (индекс авидности >65%), а также ДНК ЦМВ в соскобах с буккального эпителия и слизистой оболочки шейки матки.
Материалом для исследования выбраны эритроциты венозной крови, стабилизированной гепарином, а также плазма крови. Для достижения поставленной цели изучали интенсивность ПОЛ по содержанию его продуктов – ДК [12], и активные продукты тиобарбитуровой кислоты (ТБК-АП) [2]. Антиоксидантный статус оценивали по активности супероксиддисмутазы (СОД) при помощи наборов реагентов фирмы «RANDOX Laboratories Ltd.» (Англия), а также содержанию α-токоферола [17]. Морфологию эритроцитов изучали на микроскопе Motic (Япония) c последующей цитофотометрической обработкой данных на установке MEKOS (Москва). Мазок крови обрабатывался по программе «BioVision» (США) [8]. Ранж – 60, при разрешении в 300 пикселей.
Исследования проведены в соответствии с кодексом этических принципов Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации с поправками 2013 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Минздрава РФ №200н от 1 апреля 2016 года.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программного пакета Statistika 6.0. Проверку гипотезы о соответствии совокупностей количественных признаков закону нормального распределения осуществляли с использованием критерия Шапиро-Уилка. В случае подчинения распределения признака закону нормального распределения данные представляли в виде средней величины (M) и стандартной ошибки (m). Для определения значимости различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание p<0,05; 0,01; 0,001. В том случае, когда нулевая гипотеза о соответствии распределения признака закону нормального распределения отвергалась, использовались непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни. Для оценки тесноты связи признаков применяли корреляционный анализ с расчетом коэффициента корреляции Пирсона (r).
Результаты исследования и их обсуждение
Исследования показали, что у беременных женщин основной группы содержание первичных продуктов ПОЛ (ДК) в плазме периферической крови на 53% (p<0,001) превышало аналогичный показатель в контрольной группе (табл. 1).
Таблица 1
Состояние процессов ПОЛ и АОЗ в периферической крови у беременных с ЦМВ инфекцией
|
Показатель |
Контрольная группа |
Основная группа |
р |
|
ДК, мкмоль/л |
1,66±0,04 |
2,54±0,12 |
<0,001 |
|
ТБК-АП, ммоль/л |
7,90±0,60 |
18,12±0,18 |
<0,001 |
|
СОД, ЕД/г Hb |
365,2±4,30 |
240,0±2,50 |
<0,001 |
|
α-токоферол, мкг/мл |
1,63±0,12 |
1,29±0,08 |
<0,001 |
В норме первичные продукты ПОЛ участвуют в регулировании проницаемости мембран, скорости роста организмов и пролиферации клеток [1]. Однако в условиях ЦМВ инфекции наблюдается последующее развитие цепи процессов пероксидации, и при присоединении кислорода образуются вторичные, наиболее токсические ТБК-АП.
В результате оценки уровня вторичных продуктов ПОЛ, установлено, что у пациенток основной группы содержание ТБК-АП было достоверно (p<0,001) выше аналогичного показателя в контрольной группе (табл. 1).
Вторичные продукты ПОЛ вызывают особый интерес у исследователей, так как способны существенно влиять на функциональную активность фагоцитирующих клеток: ингибируют развитие дыхательного «взрыва» и продукцию супероксидного радикала нейтрофилами, фагоцитоз в моноцитах и нейтрофилах, обладают высокой хемотоксической активностью [1, 5].
Стационарный уровень протекания ПОЛ регулируется антиоксидантной защитой (АОЗ), которая ограничивает образование перекисных радикалов. Фермент СОД сохраняет клетки от окислительного стресса, однако в условиях ЦМВ инфекции антиоксидантный потенциал резко угнетается. Доказательством данного суждения явилось уменьшение активности эритроцитарной СОД на 34% (p<0,001) и снижение содержания α-токоферола на 21% (p<0,001), по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы (табл. 1).
При анализе взаимосвязи между активностью процессов ПОЛ и показателями АОЗ была обнаружена обратная коррелятивная связь в парах: ТБК-АП – α-токоферол (r=-0,74; p<0,001); ТБК-АП – СОД (r=-0,79; p<0,001); ДК – α-токоферол (r=-0,82; p<0,001); ДК – СОД (r=-0,85; p<0,001). Эти данные свидетельствуют о выраженной взаимозависимости между степенью увеличения процессов ПОЛ и снижением активности АОЗ.
Усиление процессов ПОЛ в эритроцитах индуцирует гидролиз фосфолипидов, образующиеся при этом высокополярные соединения (лизофосфолипиды, свободные жирные кислоты), вызывают трансформацию дискоцитов в эхиноциты [13]. Действительно, нарастание процессов ПОЛ на фоне угнетения АОЗ, появление признаков перестройки фосфолипидного слоя при ЦМВ инфекции [6], приводят к резкому нарушению взаимоотношений между липидами и белковыми структурами в мембране эритроцитов. При этом наблюдалась перегруппировка белково-липидного комплекса (БЛК) мембраны эритроцитов. БЛК укрупняются (рис.), что является причиной снижения деформационных свойств эритроцитов [10, 11].
Выявить увеличение уплотненных БЛК удается после рассмотрения мембран компьютерным методом по программе «BioVision» [8]. В мембране дискоцитов пациентов как контрольной, так и основной группы уплотненные участки были единичными и занимали незначительную площадь (рис. А1, А2; табл. 2). В эхиноцитах основной группы пациентов площадь БЛК достоверно увеличивалась (p<0,001) по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (рис. Б1, Б2; табл. 2). В мишеневидных формах эритроцитов основной группы площадь уплотненных БЛК также была повышена (p<0,001) по сравнению с показателем в контрольной группе (рис. В1, В2; табл. 2). В дегенеративных эритроцитах основной группы уплотненные участки БЛК занимали наибольшую площадь (p<0,01) по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (рис. Г1, Г2; табл. 2).
По данным морфологического исследования мазков крови беременных основной группы (табл. 2) количество дискоцитов уменьшалось в 1,6 раз (р<0,001); число дегенеративных форм и эхиноцитов, соответственно, увеличивалось в 4 (р<0,001) и 3 раза (р<0,001); а количество мишеневидных форм – в 7 раз (р<0,001).
|
|
|
|
А1
|
А2 |
|
|
|
|
Б1 |
Б2
|
|
|
|
|
В1 |
В2
|
|
|
|
|
Г1 |
Г2 |
Рис. Морфологическое строение эритроцитов периферической крови практически здоровых женщин (1) и беременных при обострении ЦМВ инфекции (2) при различном содержании в мембране белково-липидных комплексов. А – дискоциты, Б – мишеневидные эритроциты, В – эхиноциты, Г – денеративные формы. Мазок крови обрабатывался по программе «BioVision» (США). Ранж – 60, при разрешении в 300 пикселей.
Таблица 2
Площадь БЛК в эритроцитах и их морфологические формы у беременных с ЦМВ инфекцией
|
Морфологические формы эритроцитов |
Контрольная группа |
Основная группа |
р |
|
|
Дискоциты |
Содержание, % |
90,0±3,0 |
56,0±2,2 |
<0,001 |
|
Площадь БЛК, усл. ед. |
10,35±0,15 |
12,24±0,16 |
<0,001 |
|
|
Эхиноциты |
Содержание, % |
3,0±0,02 |
8,8±0,09 |
<0,001 |
|
Площадь БЛК, усл. ед. |
19,25±0,2 |
15,20±0,1 |
<0,001 |
|
|
Мишеневидные формы |
Содержание, % |
2,0±0,03 |
14,0±0,9 |
<0,001 |
|
Площадь БЛК, усл. ед. |
31,96±0,3 |
50,24±0,3 |
<0,001 |
|
|
Дегенеративные формы |
Содержание, % |
5,0±0,05 |
21,2±1,3 |
<0,001 |
|
Площадь БЛК, усл. ед. |
91,96±1,1 |
97,50±1,0 |
<0,001 |
|
Сохранение дисковидной формы имеет первостепенное значение для основной физиологической роли эритроцитов – переноса дыхательных газов, в то время как деформируемость циркулирующих клеток оказывает критическое влияние на реологические свойства крови [16]. Увеличение популяции аномальных форм красных кровяных клеток, при ЦМВ инфекции, по-видимому, связано с измененным окислительно-восстановительным статусом в эритроцитах и уменьшением и/или окислением некоторых основных белков цитоскелета, которые, как известно, являются необходимыми для поддержания горизонтальных взаимодействий в архитектуре мембраны эритроцитов [9].
Следовательно, повышенная интенсификация процессов ПОЛ, активация фосфолипазных систем при угнетении АОЗ, представляют собой важнейшие факторы, обусловливающие мембранодестабилизирующие явления.
Таким образом, на основе оценки результатов исследования установлено, что обострение ЦМВ инфекции в первом триместре беременности ассоциировано с активацией процессов ПОЛ, которые включают модификацию не только начальных, обратимых стадий (ДК) этого процесса, но и приводят к повышенному образованию вторичных ТБК-АП, усиливающих деструктивное действие, прежде всего, на мембрану эритроцитов. Образующиеся первичные и вторичные продукты ПОЛ, на фоне истощения резервов АОЗ (СОД и α-токоферол), накапливаются в возрастающих концентрациях и становятся потенциальными факторами повреждения эритроцитов, обусловливая их функциональную и метаболическую неполноценность. Метаболические нарушения и повреждения клеточных мембран вызывают увеличение популяции эхиноцитов, мишеневидных и дегенеративных форм эритроцитов, что может сопровождаться высокой вероятностью внутрисосудистого гемолиза и, тем самым, способствовать развитию гемической гипоксии, осложняющей инфекционный процесс и течение беременности.
В условиях сохраняющейся гипероксидации и угнетения АОЗ, влекущих ухудшение реологии крови, беременным женщинам с обострением ЦМВ инфекции в первом триместре целесообразно назначение препаратов, стабилизирующих липидный обмен.
